[發(fā)明專(zhuān)利]pAPN基因第16外顯子的基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202110985538.2 | 申請(qǐng)日： | 2021-08-26 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN113604502A | 公開(kāi)（公告）日： | 2021-11-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 李奎;牟玉蓮;徐長(zhǎng)江;徐奎 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N15/85 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N15/85;C12N15/113;C12N15/55;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京超凡宏宇專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463 | 代理人： | 徐樂(lè) |
| 地址： | 100193 *** | 國(guó)省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | papn 基因 16 外顯子 編輯 系統(tǒng) 及其 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體而言，提供了一種pAPN基因第16外顯子的基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的基因編輯系統(tǒng)，sgRNA對(duì)可以引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶分別靶向pAPN基因第16外顯子的兩個(gè)目標(biāo)靶位點(diǎn)，并且進(jìn)行切割編輯，實(shí)現(xiàn)pAPN基因第16外顯子缺失69bp，同時(shí)pAPN基因的其余氨基酸正常表達(dá)。pAPN基因編輯后，細(xì)胞可以有效抵抗TGEV感染，同時(shí)其他蛋白生理活性功能不受影響，具有適用范圍廣、基因編輯效率高等優(yōu)點(diǎn)。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體而言，涉及一種pAPN基因第16外顯子的基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
豬傳染性腸胃炎(transmissible gastroenteritis of pigs,TGE)是由傳染性腸胃炎病毒引起的急性、高度接觸性胃腸道傳染病。各年齡的豬均能感染，十日齡以?xún)?nèi)的仔豬最易感染，七日齡以?xún)?nèi)的仔豬感染發(fā)病死亡率可達(dá)100％。
pAPN蛋白被認(rèn)為是TGEV(transmissible gastroenteritis virus)進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵受體。至今，已有多個(gè)單位成功制備出了pAPN基因敲除豬，且攻毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)pAPN基因敲除可完全抵抗TGEV感染。但是，除了在介導(dǎo)TGEV入侵方面發(fā)揮著重要作用外，pAPN在小腸中還發(fā)揮水解肽、酰胺等結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵，從而釋放不同的N-中性氨基酸的作用。同時(shí)pAPN蛋白在其他組織中還參與很多重要的生理過(guò)程，例如細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)和血壓調(diào)節(jié)。因此直接對(duì)pAPN進(jìn)行敲除可能影響機(jī)體的其他生理功能。
因此，開(kāi)發(fā)一種既能夠抵抗TGEV感染、又能保持pAPN蛋白正常生理功能的基因編輯豬尤為重要，在豬抗病育種方面具有重要的科學(xué)和實(shí)際意義。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種pAPN基因第16外顯子的基因編輯系統(tǒng)。
本發(fā)明的第二目的在于提供上述基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三目的在于提供一種豬pAPN基因第16外顯子修飾的試劑盒。
本發(fā)明的第四目的在于提供一種pAPN基因第16外顯子修飾的細(xì)胞的制備方法。
本發(fā)明的第五目的在于提供上述制備方法得到的細(xì)胞。
本發(fā)明的第六目的在于提供一種用于豬pAPN基因第16外顯子修飾的方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
一種pAPN基因第16外顯子的基因編輯系統(tǒng)，包括核酸內(nèi)切酶和sgRNA對(duì)；
所述sgRNA對(duì)包括pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2；
編碼pAPN-sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
編碼pAPN-sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
進(jìn)一步地，所述核酸內(nèi)切酶和sgRNA對(duì)的編輯載體包括編輯載體1和編輯載體2；
編輯載體1表達(dá)核酸內(nèi)切酶和pAPN-sgRNA-1；
編輯載體2表達(dá)核酸內(nèi)切酶和pAPN-sgRNA-2。
進(jìn)一步地，編輯載體1和編輯載體2的載體骨架獨(dú)立地包括CRISPR質(zhì)粒；
優(yōu)選地，所述CRISPR質(zhì)粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，優(yōu)選為CRISPR/Cas9；
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