[發明專利]一種結直腸癌順鉑耐藥株的構建方法

有效

• 申請號: 202110985456.8
• 申請日: 2021-08-26
• 公開（公告）號: CN113774025B
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發明（設計）人: 胡清云;劉彩云;許澎
• 申請（專利權）人: 湖南豐暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 長沙大珂知識產權代理事務所(普通合伙) 43236
• 代理人: 伍志祥

本發明涉及一種結直腸癌順鉑耐藥株的構建方法，屬于生物工程技術領域。本發明提供了一種新型的耐藥株構建方法，將磁珠分選法與常規的耐藥株篩選法結合，選用P?糖蛋白(P?gp)作為耐藥靶點，用其編碼基因ABCB1的抗體標記細胞，通過磁珠分選將具備耐藥性的細胞群從親本株中分離出來。該方法構建周期短、成功率高、構建菌株耐藥性穩定。

技術領域

本發明涉及一種結直腸癌順鉑耐藥株的構建方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

目前耐藥株的篩選主要有兩種方法：濃度梯度遞增法和高濃度沖擊法。

濃度梯度遞增法：通過MTT測定親本細胞的IC50，選擇1/10的IC50濃度作為起始濃度對細胞進行沖擊，處理24h后恢復培養，同濃度沖擊數次直到細胞可在該濃度中穩定生長后再逐步提高藥物濃度重復上述步驟處理細胞，直到細胞的耐藥指數達到目的值后終止沖擊，培養細胞在維持濃度中正常生長且IC50值穩定。

高濃度沖擊法：將細胞用高濃度的藥物在梯度遞增的短時間段內(例如1h、2h、3h、4h、5h)進行沖擊，每沖擊1次恢復培養至正常狀態再進行沖擊，待細胞可以在一定濃度的藥物下正常生長且達到目的耐藥指數時停止藥物處理，更換含維持濃度藥物的培養基正常培養。

但現有的耐藥株篩選方法存在以下缺點：

(1)濃度梯度遞增法誘導細胞產生耐藥性的過程很長，通常需要6-8個月；

(2)構建耐藥株細胞的主要目的是探索腫瘤細胞對臨床化療藥物的耐藥過程，來達到優化治療的目的，但是梯度遞增法的作用過程與臨床上化療藥物的大劑量短療程的基礎原則存在差異；

(3)高濃度沖擊法由于沖擊細胞的藥物濃度較高，對細胞狀態的調整較困難，且細胞的耐藥性不穩定。

化療是治療惡性腫瘤的方法之一，主要是通過化學藥物來殺死腫瘤細胞，但是在化療過程中，有些腫瘤細胞會產生耐藥性，大大影響了腫瘤的治療效果，因此探索腫瘤的耐藥機制對于改善化療效果，選擇正確的化療方法具有十分重要的意義。順鉑屬于廣譜化療藥物，常用于結直腸癌的治療中。篩選結直腸癌細胞順鉑耐藥株，可用于分析研究結腸癌細胞耐藥的分子機制、病理機制，也可用于其他抗結腸癌藥物篩選或靶標篩選，具有很高的研究應用價值和臨床意義。

細胞在藥物的作用下，自身理化特性會發生改變，細胞膜表面出現P-糖蛋白(P-gp)，使細胞逐漸產生耐藥性。P-gp蛋白又叫多藥耐藥蛋白1(MDRP1)，由ABCB1編碼，起到一個外排泵的作用，在ATP供能下，將進入細胞內的藥物主動泵出到細胞外，從而減少藥物對細胞的傷害。

本發明擬用低濃度的順鉑處理結直腸癌細胞，再用ABCB1抗體進行標記，通過磁珠分選的方法將ABCB1標記的細胞群分離出來，便可初步得到具有一定耐藥指數的結直腸癌細胞。再在此基礎上繼續耐藥株的篩選或維持培養，以期提高耐藥細胞的篩選效率及穩定性。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種結直腸癌順鉑耐藥株的構建方法。本發明提供了一種新型的耐藥株構建方法，將磁珠分選法與常規的耐藥株篩選法結合；選用了P-糖蛋白(P-gp)作為耐藥靶點，用其編碼基因ABCB1的抗體標記細胞，通過磁珠分選將具備耐藥性的細胞群從親本株中分離出來。該方法構建周期段、成功率高、構建菌株耐藥性穩定。

本發明的技術方案如下：

本發明提供了一種順鉑耐藥株的構建方法，所述構建方法包括以下步驟：

(1)測定順鉑作用后的腫瘤細胞的IC50值，選擇所述IC50值的0.8-1.2倍濃度的順鉑預處理腫瘤細胞；

(2)再以ABCB1抗體對順鉑預處理后的腫瘤細胞進行標記，將ABCB1標記的細胞群分離出來，即得順鉑耐藥株。

進一步地，所述步驟(1)中，所述腫瘤細胞為人結直腸癌細胞。