[發(fā)明專利]一種結(jié)直腸癌順鉑耐藥株的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110985456.8
• 申請日: 2021-08-26
• 公開（公告）號: CN113774025B
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡清云;劉彩云;許澎
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南豐暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 長沙大珂知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43236
• 代理人: 伍志祥

1.一種順鉑耐藥株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)測定順鉑作用后的腫瘤細(xì)胞的IC50值，選擇所述IC50值的0.8-1.2倍濃度的順鉑預(yù)處理腫瘤細(xì)胞，所述腫瘤細(xì)胞為人結(jié)直腸癌細(xì)胞；

(2)再以ABCB1抗體對順鉑預(yù)處理后的腫瘤細(xì)胞進行標(biāo)記，利用磁珠分選將ABCB1標(biāo)記的細(xì)胞群分離出來，即得順鉑耐藥株；

所述利用磁珠分選分離ABCB1標(biāo)記的細(xì)胞群，包括以下步驟：

1)取對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，收集到離心管中，并計數(shù)；

2)取1×10⁸個細(xì)胞，300g離心10min，去掉上清；

3)用1mLbuffer重懸，加入100μLPE-CD243Antibody，混勻；

4)4℃避光孵育10min；

5)300g離心10min，去上清，加入1mLbuffer清洗掉未標(biāo)記的抗體；

6)300g離心10min，重復(fù)清洗1次；

7)棄上清，加入800μLbuffer重懸細(xì)胞；

8)加入200μLAnti-PE磁珠，混勻，4℃孵育15min；

9)用1mLbuffer清洗細(xì)胞兩次，300g離心10min，棄上清；

10)加入500μLbuffer重懸細(xì)胞；

11)將MACS分離器放在磁力架上，再將MS分選柱放入分離器中，將細(xì)胞懸液滴加過柱，此時CD243標(biāo)記了的細(xì)胞會吸附在分選柱上，再用buffer沖洗3次去掉多余細(xì)胞，每次加入500μL；

將MS分選柱從分離器上取下，放入收集管中，加入1mLbuffer，使用推進器將標(biāo)記了CD243的細(xì)胞洗脫下來，收集管得到的就是CD243的陽性細(xì)胞，即ABCB1標(biāo)記的細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述測定順鉑作用后的腫瘤細(xì)胞的IC50值利用MTT法進行，包括以下步驟：

1)用0.25％的胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，將細(xì)胞收集至離心管中，計數(shù)；

2)細(xì)胞鋪板：取1塊96孔板，按照實驗分組，每組樣品設(shè)置5個平行孔，每孔5000個細(xì)胞鋪至96孔板中；

3)放入5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24h后加藥；

4)配置不同濃度梯度的順鉑，加入到96孔板中；

5)72h后，取出96孔板，每孔避光加入10μLMTT溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4h；

6)取出96孔板，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO溶解紫色結(jié)晶；

7)490nm波長下測定MTT值；

8)計算IC50。