[發明專利]基于空頻域混合式重建的超分辨結構光照明顯微成像方法

有效

• 申請號: 202110985056.7
• 申請日: 2021-08-25
• 公開（公告）號: CN113670878B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 汪召軍;雷銘;梁言生
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 岳東升;楊帥峰

本發明公開了一種基于空頻域混合式重建的超分辨結構光照明顯微成像方法，包括：1)產生條紋狀照明光場；2)利用條紋狀照明光場分別在不同的條紋方向以及不同的相移步數的情況下照明并激發待測樣品產生熒光信號；3)采集熒光信號，獲得由不同的條紋狀照明光場激發的原始熒光圖像；4)若原始熒光圖像中的不包括離焦背景，則利用空頻域混合式重建算法處理不包括離焦背景的原始熒光圖像，獲得超分辨圖像；若原始熒光圖像中包括離焦背景，則利用空頻域混合式重建算法處理包括離焦背景的原始熒光圖像，獲得具有層析效果的超分辨圖像。本發明將重建過程所需的計算量減少二倍以上，可以將重建速度提升至現有超分辨重建算法的80倍以上。

技術領域

本發明屬于光學技術領域，涉及一種光照明顯微成像方法，尤其涉及一種可廣泛應用于生物學、醫學、微電子學及材料科學等領域進行研究的基于空頻域混合式重建的超分辨結構光照明顯微成像方法。

背景技術

傳統光學顯微鏡的空間分辨率受限于光的衍射極限，僅能達到半個光波長量級，極大地限制了光學顯微鏡的應用范圍。如何實現更高空間分辨率的成像一直是光學顯微領域的重要研究課題之一。克服衍射極限的本質在于使系統能夠區分衍射極限區域內的熒光分子，一般可通過兩類方法實現。第一類方法通過在不同時間點隨機激活并定位衍射極限區域內的單個熒光分子來達到區分不同熒光分子的目的，包括光激活定位顯微(Photoactivated Localization Microscopy，PALM)和隨機光學重建顯微(StochasticOptical Reconstruction Microscopy，STORM)，二者統稱為單分子定位顯微(SingleMolecule Localization Microscopy，SMLM)。第二類則是利用特殊的照明光場對衍射受限的區域內的熒光分子的發射信號進行調制，從而對這些分子進行區分，包括受激發射損耗顯微(Stimulated Emission Depletion，STED)以及超分辨結構光照明顯微(Super-resolution Structured Illumination Microscopy，SR-SIM)。目前超分辨熒光顯微成像技術的最高分辨率已接近電子顯微鏡的分辨水平，為現代生物醫學提供強有力的工具，同時將相關研究推向新的深度。在眾多超分辨成像方法中，結構光照明顯微系統SIM具有最高的成像速率和最低的激發功率密度(～1W/cm²)，故可以進行較長時間的動態超分辨觀測。另外，線性SIM與傳統的熒光分子、熒光染料兼容，無需特殊的光開關染料或蛋白，大大擴展了超分辨成像的應用范圍。這些優勢使得SIM在細胞器、生物大分子及其組裝體的動態行為觀測中備受青睞。

在SR-SIM的成像流程中，超分辨重建速度快慢決定了成像速度和用戶體驗。迄今為止，大多數SR-SIM的重建算法都是建立在Heintzmann和Gustafsson兩人所構建的頻率域重建方法基礎上的。該方法首先將采集到的原始圖像全部變換到頻域，并通過一組線性方程求解得到樣品的零階分量(低頻信息)和正負一階分量(高頻信息)。然后，作為去卷積過程的準備步驟，每個分量分別與光學傳遞函數的共軛相乘，并移動到它們的真實位置。最后，通過將這些分量疊加起來，并將它們的和除以擴展的光學傳遞函數的平方加上一個小常數，將頻譜反變換回實空間得到超分辨圖像，并完成去卷積運算(通常可以采用維納去卷積、Richardson-Lucy去卷積、Total Variation去卷積、Hessian去卷積等)。此外，對于較厚的生物樣品，為了抑制背景熒光以及周期性的蜂窩偽影，一般將頻譜分量與經驗衰減函數相乘，以獲得具有光切片能力的超分辨率圖像。具體流程如圖2所示。上述重建方式在提高空間分辨率和切片能力方面非常有效，因此獲得了廣泛應用，包括商業的SR-SIM設備中以及諸如fair-SIM，Open-SIM和SIMToolbox這樣的開源工具包中。然而，這種主流的SIM重建算法基于頻率域重建，涉及大量的復雜運算，因此重建過程十分耗時，不利于進行實時的超分辨成像。