[發明專利]一鍋式核酸-抗體共檢測方法及應用在審

申請號：	202110981759.2	申請日：	2021-08-25
公開（公告）號：	CN113702641A	公開（公告）日：	2021-11-26
發明（設計）人：	丁顯廷;嚴思嘉	申請（專利權）人：	上海交通大學
主分類號：	G01N33/577	分類號：	G01N33/577;G01N33/569;C12N15/11;G01N33/68
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摘要：
搜索關鍵詞：	一鍋核酸抗體檢測方法應用
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【說明書】：

本發明公開了一種一鍋式核酸抗體共檢測方法及應用，涉及體外診斷領域。本發明通過設計制備特異性抗抗體?寡核苷酸鄰位延伸探針、多重PCR引物和Taqman探針，使用抗原預包被反應管捕獲待測樣品中的抗體，進行鄰位延伸反應，最終通過反轉錄熒光定量PCR擴增技術，讀取多重探針熒光強度，實現生物樣品中核酸和抗體的同時檢測，對于預測疾病的發生發展，提高臨床診斷的準確率具有重大意義。

技術領域

本發明涉及體外診斷領域，尤其涉及一種核酸和抗體共檢測方法。

背景技術

蛋白質(抗原或抗體)和核酸(DNA或RNA)是體外診斷的兩個主要目標類別，通常需要獨立的平臺，無法在單個平臺上同時得到核酸和蛋白檢測結果。

核酸檢測涉及各種聚合酶鏈反應(PCR)策略，如經典PCR、實時PCR、多重PCR和數字PCR，可以檢測低水平的核酸；蛋白質檢測一般采用結合電場效應、納米結構氧化鋯、微流體、熒光、磁阻納米線網、光纖、電化學等方法的生物傳感器和夾心免疫分析，然而，這些方法由于缺乏信號放大設備導致檢測靈敏度有限。

微流控技術由于芯片制備所用材料生物相容性不夠好，可能會引起細胞功能發生改變。同時，由于芯片制備工藝復雜，對單細胞分離檢測難以控制，大規模推廣仍有較大困難。單細胞蛋白質印跡法(western blot)結合了聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的分子篩效應，該方法主要用于細胞裂解液中的痕量蛋白表達，但在生物樣品中檢測游離的痕量蛋白及與核酸共檢測的應用目前未見報道。鄰近結扎RNA測定(PLAYR)，需要結合流式細胞術和質量流式細胞術，有時可能無法找到靶標所對應的復合檢測要求的抗體探針，限制了方法的應用。此外，該方法需要在大型質譜流式細胞分析儀上使用，本質上受到可用鑭系金屬標簽數量的限制。目前大型質譜流式細胞分析儀和鑭系金屬標簽均需從國外進口，貨期長且價格昂貴。鄰位連接技術(PLA)與核酸檢測連用，由于T4連接酶在復雜生物樣本(包括血清或血漿)中容易失去活性，影響反應效率，導致靈敏度降低，應用仍然受到限制。

綜上所述，現有方法存在需要復雜而昂貴的儀器，分析時間長，靈敏度和定量分析能力有限，以及需要精通操作多個平臺的熟練技術人員等缺陷。目前，尚未有技術可以在一臺設備上同時檢測血清中的抗體和核酸。

發明內容

有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是在一臺設備上同時對生物復合物樣品中的蛋白質和核酸進行定量檢測，以降低漏檢率，提高檢測效率。

為實現上述目的，本發明提供了一種一鍋式核酸-抗體共檢測方法，包括以下步驟：

步驟1、設計制備特異性抗抗體-寡核苷酸鄰位延伸探針、多重PCR引物和Taqman探針；

步驟2、使用抗原預包被反應管；

步驟3、在上述反應管中加入待測生物樣品稀釋液；

步驟4、將特異性抗抗體-寡核苷酸探針加入洗滌后的反應管；

步驟5、在反應管中加入延伸體系，進行鄰位延伸反應；

步驟6、提取樣品RNA,加入反應管中，進行反轉錄熒光定量PCR，讀取多重探針熒光強度，實現對待測樣品中目標核酸-抗體的定量分析。

步驟1所述特異性抗抗體-寡核苷酸鄰位延伸探針包括與待測樣品中抗體結合的抗抗體和與抗抗體3'端連接的寡核苷酸序列。

所述寡核苷酸序列包括與5'連接探針相對應的堿基和PCR中使用的引物的結合位點。