[發(fā)明專利]一鍋式核酸-抗體共檢測方法及應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110981759.2 | 申請日： | 2021-08-25 |
| 公開（公告）號： | CN113702641A | 公開（公告）日： | 2021-11-26 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 丁顯廷;嚴(yán)思嘉 | 申請（專利權(quán)）人： | 上海交通大學(xué) |
| 主分類號： | G01N33/577 | 分類號： | G01N33/577;G01N33/569;C12N15/11;G01N33/68 |
| 代理公司： | 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220 | 代理人： | 鄭立 |
| 地址： | 200240 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一鍋 核酸 抗體 檢測 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種一鍋式固相核酸-抗體共檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟1、設(shè)計制備抗抗體-寡核苷酸鄰位延伸探針、多重PCR引物和Taqman探針；
步驟2、使用抗原預(yù)包被反應(yīng)管；
步驟3、在反應(yīng)管中加入待測生物樣品；
步驟4、將抗抗體-寡核苷酸探針加入反應(yīng)管；
步驟5、在反應(yīng)管中加入延伸體系，進(jìn)行鄰位延伸反應(yīng)；
步驟6、進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR，讀取多重探針熒光強(qiáng)度，實現(xiàn)對目標(biāo)核酸-抗體的定量分析。
2.權(quán)利要求1所述的一鍋式固相核酸-抗體共檢測方法，其特征在于步驟1所述特異性抗抗體-寡核苷酸鄰位延伸探針包括抗抗體和寡核苷酸序列，所述抗抗體與寡核苷酸連接方式包括通過胺-巰基交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，鏈霉親和素-寡核苷酸與生物素化多克隆抗體反應(yīng)。
3.權(quán)利要求2所述的一鍋式核酸-抗體共檢測方法，其特征在于所述寡核苷酸序列包括與Taqman探針、PCR引物的結(jié)合位點。
4.權(quán)利要求1所述的一鍋式核酸-抗體共檢測方法，其特征在于步驟2具體操作如下：
步驟2.1、將PCR管用8％戊二醛溶液處理，使用包被緩沖液稀釋抗原，取稀釋后抗原加入到處理后的PCR管中孵育過夜；
步驟2.2、將處理后的預(yù)包被管用洗滌緩沖液洗滌，添加1％BSA的1×PBS封閉后再洗滌。
5.權(quán)利要求1所述的一鍋式核酸-抗體共檢測方法，其特征還在于步驟3具體操作如下：
步驟3.1、在抗原包被管中加入待測樣品孵育，然后用洗滌緩沖液洗滌；
步驟3.2、在管中加入探針后，在室溫下?lián)u動，用洗滌緩沖液洗滌。
6.權(quán)利要求1所述的一鍋式核酸-抗體共檢測方法，其特征還在于步驟5所述延伸體系包含5x反應(yīng)緩沖液，T4 DNA聚合酶和dNTP混合物。
7.權(quán)利要求1～7所述任何一項一鍋式核酸-抗體共檢測方法在新型冠狀肺炎病毒檢測中的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟：
步驟1、設(shè)計合成新型冠狀肺炎病毒特異性抗抗體-寡核苷酸鄰位延伸探針、四重PCR引物、四重Taqman探針；
步驟2、使用SARS-CoV-2核衣殼蛋白稀釋液預(yù)包被反應(yīng)管；
步驟3、加入抗抗體-寡核苷酸、延伸體系進(jìn)行固相鄰位延伸反應(yīng)；
步驟4、進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR，讀取四重探針熒光強(qiáng)度，實現(xiàn)定量分析；
優(yōu)選地，四重Taqman探針包括IgG Taqman探針，IgM Taqman探針，RdRP探針，E探針，序列是序列表中的SEQ NO.5，SEQ NO.10，SEQ NO.13，SEQ NO.16所示的序列；四組PCR引物包括IgG引物、IgM引物、RdRP引物、E引物，序列是序列表中的SEQ NO.3，SEQ NO.4，SEQ NO.8，SEQ NO.9，SEQ NO.11，SEQ NO.12，SEQ NO.14，SEQ NO.15所示的序列；
優(yōu)選地，步驟1中所述抗抗體-寡核苷酸，抗抗體包括人源抗N-IgG抗體和人源抗N-IgM抗體,交聯(lián)的寡合甘酸序列是序列表中的序列是序列表SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.6和SEQ NO.7所示的序列；
優(yōu)選地，步驟1中所述四重Taqman探針5’端修飾熒光基團(tuán)，3’端修飾淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)包括FAM、Hex、ROX或Cy5，淬滅基團(tuán)包括BHQ1、BHQ2或BHQ3；
優(yōu)選地，步驟2中所述SARS-CoV-2核衣殼蛋白稀釋液濃度為2ug/ml～8ug/ml；
優(yōu)選地，步驟4中所述擴(kuò)增反應(yīng)程序包括在90℃逆轉(zhuǎn)錄3分鐘和60℃逆轉(zhuǎn)錄5分鐘，然后在95℃逆轉(zhuǎn)錄5秒，在60℃逆轉(zhuǎn)錄30秒，45個循環(huán)。
8.如權(quán)利要求7所述的一鍋式核酸-抗體共檢測方法檢測新型冠狀肺炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包括預(yù)包被PCR管、延伸單元和反轉(zhuǎn)錄單元。
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