[發明專利]一種用于微生物孢子的快速檢測方法

在審

• 申請號: 202110973148.3
• 申請日: 2021-08-24
• 公開（公告）號: CN114235760A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 付玉明;孫儒馨;劉紅
• 申請（專利權）人: 北京航空航天大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種用于微生物孢子的快速檢測方法。1)微生物孢子收集，空氣中的微生物孢子收集自空氣采樣器濾網，表面微生物孢子收集自采樣拭子；2)非孢子微生物去除；3)微生物孢子離心、濃縮、熱裂解；4)檢測試劑配制與微生物孢子AMP檢測；5)微生物孢子數量計算。本發明適用于對潔凈間空氣和表面微生物孢子進行檢測，相較于常規微生物孢子培養的檢測豐富，本方法更加便捷，檢測時間和所需成本大幅降低，可實現潔凈間空氣和表面微生物孢子的即時檢測，顯著提高了微生物孢子檢測能力。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體屬于微生物孢子快速檢測領域，尤其涉及一種基于微生物孢子AMP與標準UTP混合發射熒光強度降低的微生物孢子快速檢測方法，可大幅度縮短微生物孢子的檢測時間。

背景技術

微生物作為地球上廣泛存在的生命形態，具有很強的極端環境適應性。在空間站和航天員乘艙內有多種微生物被檢出，具有腐蝕性、致病性等危害較大的真菌有黃曲霉、黑曲霉、桔灰曲霉、臘葉芽枝霉和雜色曲霉等，細菌有葡萄球菌、鏈球菌和桿菌等，以上微生物均具有產孢特性，在長期適宜的溫濕度環境下，微生物會附著在航天器艙體內部材料和設備的表面形成生物膜，腐蝕材料并加速材料自身的老化速度，影響材料自身力學、熱學和絕緣性能等，進而影響航天器壽命和在軌運行可靠性，同時微生物也會危害人類健康。因此，在航天器生產組裝過程中，實時監測微生物孢子污染對指導后續消殺，保證航天器安全具有重要作用。

目前，為避免微生物的存在導致航天器中的設備出現損壞，國際空間站密封艙體采用大量的金屬與高分子材料，并對其進行嚴格消殺。在這種情況下，極端微生物會通過產孢的方式，抵抗消殺操作所產生的極端環境，保持自身的生理活性，在環境適宜時由休眠態轉變為營養體狀態在潔凈間內部和航天器表面附著和生長。然而，目前被廣泛使用的針對微生物孢子的檢測方法仍然是以培養法為主，囿于培養法的微生物孢子檢測時間的限制，難以實時得到航天器表面微生物孢子信息；同時，實驗室可培養微生物孢子只占到微生物孢子總數的0.1％-10％，會嚴重低估航天器表面微生物孢子量。因此，提出一種不依賴于培養的微生物孢子快速檢測方法，可以提高我國航天器微生物孢子檢測水平。而且該檢測方法在食品藥品檢驗、水源檢測和炭疽桿菌檢測方面都可廣泛應用。

發明內容

為快速檢測微生物孢子，提供采樣位置微生物孢子污染信息，本發明提供了一種基于AMP的UTP熒光強度降低檢測微生物孢子的微生物孢子快速檢測方法。

微生物孢子快速檢測方法，取樣步驟如下：

1)微生物孢子收集，空氣中的微生物孢子收集自空氣采樣器濾網，表面微生物孢子收集自采樣拭子；

2)非孢子微生物去除；

3)微生物孢子離心、濃縮、熱裂解。

微生物孢子快速檢測方法，檢測步驟如下：

1)使用移液器吸取50μL待測樣本至特定反應容器；

2)使用移液器吸取50μLUTP溶液至特定反應容器中，與樣品混合靜置5min；

3)將特定反應容器放置于單光子計數器感光區，加入熒光素/熒光素酶溶液獲得熒光強度；

4)根據標準曲線，計算微生物孢子數量。

微生物孢子快速檢測方法，試劑配制步驟如下：

1)熒光素/熒光素酶溶液，熒光素濃度為0.1mmol/mL，熒光素酶濃度為0.1mg/mL，-18℃保存。

2)AMP標準溶液，AMP標準溶液母液濃度為5mg/mL，共稀釋6個梯度，0.5mL/管分裝，-18℃保存。

上述微生物孢子快速檢測方法中，所述熒光反應主體為AMP、UTP和熒光素/熒光素酶溶液。