[發明專利]蓮葉桐核酸提取改良版CTAB法

在審

• 申請號: 202110973065.4
• 申請日: 2021-08-24
• 公開（公告）號: CN113584018A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 王勇;于靖;倪靚;譚佐莉;張修含;張世杰
• 申請（專利權）人: 海南師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 茍銘

本發明屬于分子生態學實驗領域，具體提供了一種針對瀕危半紅樹植物蓮葉桐基因組DNA改良版的CTAB提取方法。瀕危半紅樹植物蓮葉桐，因富含多糖多酚，其組織研磨液極其粘稠，提取質量好的核酸極其困難。本發明在傳統CTAB法基礎上采用改進的裂解液對細胞進行裂解，并通過一定比例的Tris平衡酚?氯仿?異戊醇混合液進行抽提。再用改進體積的醋酸鈉?異丙醇進行沉淀DNA、純化DNA，從而獲得高質量的基因組DNA。采用本發明提供的瀕危半紅樹植物蓮葉桐核酸提取方法提取的DNA濃度高、純度高，還不易降解，最重要的是能夠有效去除多糖多酚。為后續的PCR擴增、分子標記技術開發、基因組文庫構建等分子生物學實驗奠定基礎。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種瀕危半紅樹植物蓮葉桐核酸提取改良版CTAB法。

背景技術

蓮葉桐(Hernandia nymphaeifolia(J.Presl)Kubitzki)是蓮葉桐科、蓮葉桐屬常綠喬木，蓮葉桐材料因富含多糖、多酚、高蛋白，成分特殊，提取液極其粘稠，且容易褐化，所以核酸提取較困難。

傳統的CTAB法如下：

(1)稱取0.2g樣品用液氮研磨成粉,置于2ml離心管中，加入800uL經65℃預熱的CTAB裂解液(2％(m/v)CTAB，0.1mol/LTris-HClpH8.0,20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl).充分混合以后，將其混勻在水浴鍋中65℃加熱40min,每10min顛倒搖勻數次。

(2)冷卻至室溫加入等體積的氯仿:異戊醇＝24:1,后充分的顛倒搖勻，25℃，轉速設置為每分鐘12000rpm,離心約10min。

(3)取上清,加入已預熱的1/10倍體積的CTAB/NaCl，充分顛倒混勻。再用相同體積的比例為24:1的氯仿和異戊醇再次抽提，然后低溫條件下離心10min，將上清吸取置于2ml的EP管中。

(4)吸取相同體積的CTAB沉淀液于離心管中，進行充分顛倒混勻，在4℃，轉速設置為每分鐘3500rpm，離心5min，然后取上清，再用500μL的TE緩沖液溶解沉淀，溶解后再加入0.6倍體積的異丙醇，充分顛倒混勻，在4℃，轉速設置為每分鐘12000rpm,離心15min。

(5)倒上清液，取出一定量70％的乙醇沖洗白色沉淀2次。放置在室溫條件下進行風干之后用0.1mLTE緩沖液進行溶解。

采用傳統的CTAB法提取的蓮葉桐植物基因組DNA過程中出現裂解時細胞裂解不完全，抽提過程中除糖和蛋白不完全，DNA沉淀出現膠狀，點樣跑膠時出現槍頭拉絲，DNA主條帶不清晰等問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題為：如何提供一種適用于蓮葉桐核酸提取的方法，解決采用傳統CTAB法提取時出現的細胞裂解不完全，抽提時多糖處理不干凈，點樣跑膠時出現槍頭拉絲、DNA主條帶不清晰等問題。

本發明的技術方案為：蓮葉桐核酸提取的方法，包括如下步驟：

(1)取適量新鮮蓮葉桐葉片，置于預冷的研缽中，加入液氮充分研磨，將粉末轉至離心管中，加入預熱溫度為65℃的裂解液，混勻，加入RNA酶，渦旋震蕩1min，混勻后65℃水浴鍋中水浴加熱40min，每隔10min顛倒搖勻一次，所述裂解液組成為：2％(m/v)CTAB,0.1mol/L Tris-HCl pH8.0,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,2％(m/v)β疏基乙醇，2％(m/v)PVP；

(2)放置冷卻至室溫，加入等體積的Tris平衡酚︰氯仿︰異戊醇＝25︰24︰1,在轉速為11000～13500rpm室溫下離心10～15min；

(3)取上清液轉入一新離心管，加入1/10倍體積的3mol/LNaAc和等體積的異丙醇，混勻于-20℃放置40～60min，在轉速為11000～13500rpm 4℃離心10～15min；