[發明專利]核膜蛋白敲降在干細胞移植方面的應用

有效

• 申請號: 202110972070.3
• 申請日: 2021-08-24
• 公開（公告）號: CN113652428B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 邢玲燕;王家琪;袁卉華;陳罡
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;G01N33/68
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馬玉雯

本發明公開了一種核膜蛋白敲降在干細胞移植方面的應用，具體包括步驟1)、在線設計2對針對核膜蛋白的siRNA引物，構建慢病毒載體；步驟2)、體外慢病毒介導的核膜蛋白敲降對神經干細胞增殖分化進行干預；步驟3)、體內慢病毒介導的核膜蛋白敲降對神經干細胞增殖分化進行干預。本發明將LBR(核膜蛋白)用于抑制干細胞的分裂，促進干細胞的分化；神經干細胞移植后會可能存在較強的分裂能力，存在潛在致癌性。核膜蛋白敲降后，細胞分裂能力顯著降低，因此該方法可廣泛用于干細胞移植帶來的致癌性問題。

技術領域

本發明涉及核膜蛋白敲降在干細胞移植方面的應用，屬于干細胞移植領域。

背景技術

干細胞移植已成為再生領域的重要議題，然而其存在明顯的致癌風險。常見的手段包括(i)化學治療，(ii)基因治療，和(iii)免疫治療。免疫治療存在高成本、批次之間的差異、非特異性抗體結合，和副作用大等缺陷?；瘜W小分子的治療則效率相對低下，目前難以滿足臨床的需求。基因治療通常針對重編程轉錄因子，然而對重編程因子進行改造，容易導致細胞狀態發生嚴重損害，不利于干細胞分化。

中樞神經系統損傷后，除原發性機械損傷直接造成的神經元死亡外，繼發性損傷也會導致神經元持續性的凋亡、壞死，由此出現不同程度的軸突缺失及功能障礙。另一方面，成年哺乳動物的脊髓區域干細胞數量有限，且損傷后主要向膠質細胞而非神經元轉化。因此，在哺乳動物受損區域補充新生神經元及修復上下行神經通路，對神經損傷修復具有重要意義。常見的方法是外源干細胞的移植使其在體內分化為神經元。但神經干細胞的增殖能力較強，存在嚴重的致癌風險，目前對其調控手段仍極為有限。

發明內容

本發明提供了一種核膜蛋白敲降在干細胞移植方面的應用，將LBR(核膜蛋白)用于抑制干細胞分裂，促進其分化，可廣泛用于干細胞移植帶來的致癌性問題。

本發明為解決上述技術問題采用以下技術方案：

一種核膜蛋白敲降在干細胞移植方面的應用，包括以下步驟：

步驟1)、在線設計2對針對核膜蛋白的siRNA引物，引物序列如SEQ?ID?No.1和SEQID?No.2所示，構建慢病毒載體lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2；

步驟2)、體外慢病毒介導的核膜蛋白敲降對神經干細胞增殖分化進行干預；

21)神經干細胞的獲取及傳代：取分離的大鼠神經干細胞在培養基中進行傳代，原代培養物生長5天，神經干細胞每4天傳代一次，取第2-4代的神經干細胞用于所有實驗；

22)取步驟1)所構建的慢病毒載體lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2，其MOI＝10，分別對步驟21)獲取的第2-4代的神經干細胞進行轉染；12小時后加入500μl完全培養基；病毒轉染后72小時，檢測神經干細胞中的GFP表達以確定病毒滴度；

步驟3)、體內慢病毒介導的核膜蛋白敲降對神經干細胞增殖分化進行干預；

31)在小鼠脊髓損傷后1-2周分別注射步驟22)經病毒轉染后的神經干細胞10萬-100萬個；

32)在神經干細胞體內移植后的2-8周內，利用慢病毒介導的核膜蛋白敲降，即通過微量注射泵進行慢病毒載體的注射，注射濃度為10⁶-10⁸/μL，注射體積為0.5μL-4μL；

33)損傷后6周對小鼠灌流固定，取相應脊髓節段，30μm連續切片，每個樣品隨機取3張切片進行免疫組化，對神經干細胞的分裂分化進行鑒定。

進一步的，所述步驟1)包括以下步驟：

11)、在線設計2對針對核膜蛋白的siRNA引物，引物序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?IDNo.2所示，并合成相關引物；