[發(fā)明專利]核膜蛋白敲降在干細(xì)胞移植方面的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110972070.3
• 申請日: 2021-08-24
• 公開（公告）號(hào): CN113652428B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢玲燕;王家琪;袁卉華;陳罡
• 申請（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;G01N33/68
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馬玉雯

1.一種核膜蛋白敲降在體外對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化進(jìn)行干預(yù)的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1)、在線設(shè)計(jì)2對針對核膜蛋白的siRNA，所述siRNA序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?IDNo.2所示，構(gòu)建慢病毒載體lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2；

步驟2)、體外慢病毒介導(dǎo)的核膜蛋白敲降對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化進(jìn)行干預(yù)；

21)神經(jīng)干細(xì)胞的獲取及傳代：取分離的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代，原代培養(yǎng)物生長5天，神經(jīng)干細(xì)胞每4天傳代一次，取第2-4代的神經(jīng)干細(xì)胞用于所有實(shí)驗(yàn)；

22)取步驟1)所構(gòu)建的慢病毒載體lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2，其MOI＝10，分別對步驟21)獲取的第2-4代的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；12小時(shí)后加入500μL完全培養(yǎng)基；病毒轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，檢測神經(jīng)干細(xì)胞中的GFP表達(dá)以確定病毒滴度；

所述步驟1)包括以下步驟：

11)、在線設(shè)計(jì)2對針對核膜蛋白的siRNA，所述siRNA序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?IDNo.2所示；

12)、正反義寡核苷酸鏈退火；按以下體系配制退火反應(yīng)體系：

1μg/μL正義寡核苷酸鏈5μL；

1μg/μL反義寡核苷酸鏈5μL；

ddH₂O?15μL；

反應(yīng)條件：95℃，反應(yīng)5分鐘，后緩慢降至室溫，得到退火后的寡核苷酸雙鏈；

其中，lbr-shRNAi-1的正義寡核苷酸鏈如SEQ?ID?No.3所示；對應(yīng)的反義寡核苷酸鏈SEQ?ID?No.4所示；

lbr-shRNAi-2的正義寡核苷酸鏈如SEQ?ID?No.5所示；對應(yīng)的反義寡核苷酸鏈SEQ?IDNo.6所示；

13)、用AgeI和EcoRI雙酶切線性化質(zhì)粒GV112，得到改造后的線性化載體；酶切體系是：

反應(yīng)條件：37度3小時(shí)；

14)、連接步驟12)退火形成的寡核苷酸雙鏈與步驟13)所得改造后的線性化載體，得到重組質(zhì)粒；按照以下體系配制連接反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件：4℃過夜；

15)、轉(zhuǎn)化及鑒定

將步驟14)連接所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)的大腸桿菌體內(nèi)，以從含有抗生素的LB平板上挑取單菌落，進(jìn)行測序；

16)、將上述連接重組的質(zhì)粒和包裝輔助質(zhì)粒pHelper?1.0及pHelper?2.0，轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中產(chǎn)生復(fù)制缺陷型慢病毒；收集上清液，并離心濃縮，純化得到慢病毒載體；通過測量共表達(dá)的GFP確定病毒滴度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述核膜蛋白敲降在體外對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化進(jìn)行干預(yù)的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟15)中鑒定包括以下步驟：

151)配制如下反應(yīng)體系，震蕩混勻，短暫離心；

ddH₂O?9.2μL；

2×Taq?Plus?Master?Mix?10μL；

上游引物：10μM，0.4μL；序列如SEQ?ID?No.7所示；

下游引物：10μM，0.4μL；序列如SEQ?ID?No.8所示；

152)在超凈工作臺(tái)中，用無菌的槍頭挑單個(gè)菌落至20μL至鑒定體系中，吹打混勻，置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系共20μL；

153)將鑒定出的陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種于適量含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-16h，取適量菌液進(jìn)行測序，測序引物如SEQ?ID?No.8所示；若測序結(jié)果含SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2則成功。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述核膜蛋白敲降在體外對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化進(jìn)行干預(yù)的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟21)中培養(yǎng)基包括：DMEM/F12、1X?B27、1X?PS、20ng/mL?EGF和20ng/mLbFGF。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述核膜蛋白敲降在體外對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化進(jìn)行干預(yù)的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟22)中完全培養(yǎng)基包括：DMEM/F12、1X?B27、1XPS、50ng/ml?EGF和50ng/ml?bFGF。