[發(fā)明專利]一種兩步酶法制備(R)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的方法

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• 申請日: 2021-08-24
• 公開（公告）號: CN113667704A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發(fā)明（設計）人: 章銀軍;夏元丹;魏立天;周鉻鵬;謝添莉;汪釗
• 申請（專利權）人: 浙江工業(yè)大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N11/082;C12N9/18;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種兩步酶法制備(R)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進行：(1)以固定化酯酶PAE為催化劑，以(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯為底物，以水為溶劑，在30-40℃反應完全，將反應液離心，收集上清液；向上清液中加入乙酸乙酯進行萃取，萃取后得到乙酸乙酯層和水層；取乙酸乙酯層旋蒸至干，回收得到乙酸乙酯和(S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯；水層使用4M的HCl水溶液調(diào)節(jié)pH至2，加入乙酸乙酯進行萃取，回收乙酸乙酯層并用水重復萃取1-3次，再次回收乙酸乙酯層，旋蒸至干，回收乙酸乙酯，同時得到(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸；所述固定化酯酶PAE是將含SEQ ID NO.1所示酯酶PAE基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體超聲破碎提取純酶液；再將純酶液以四甲氧基硅烷為載體，以聚乙烯亞胺為交聯(lián)劑制備固定化酯酶PAE；(2)將步驟(1)制備的(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸與脂肪酶、無水甲醇、水和正己烷混合，在30-60℃反應2-14h，反應液分離出正己烷相之后的溶液旋蒸濃縮，得到(R)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中固定化酯酶PAE按如下步驟制備：1)純酶液：將含SEQ ID NO.1所示酯酶PAE基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體超聲破碎提取純酶液；2)固定化：將四甲氧基硅烷和1mmol/L的HCl水溶液按體積比1：1混合，在磁力攪拌器的作用下200rpm攪拌0.5-2h，得到1mol/L的硅前體溶液；在室溫下，將pH 7.0硅前體溶液、pH 7.0的1g/L聚乙烯亞胺水溶液和步驟1)制備的酯酶PAE純酶液進行等體積混合，在磁力攪拌器的作用下200rpm反應2-10min后，在5000rpm下離心5min，沉淀使用pH 7.2、50mM的PBS緩沖液沖洗除去未被包裹的酯酶酶液和過量的反應液，將洗滌后的沉淀物在-60℃、100Pa冷凍干燥，得到固定化酯酶PAE。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中底物用水溶解制成0.1-5mol/L底物溶液，所述底物溶液體積用量以催化劑重量計為50-500mL/g。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于步驟1)純酶液按如下方法制備：將含SEQ IDNO.1所示酯酶PAE基因的工程菌接種至LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h后，轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.6，以體積濃度1％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在24℃、200rpm條件下培養(yǎng)10h，發(fā)酵液在4℃、12000rpm下離心10min，收集濕菌體；將濕菌體以0.1g/ml的量加入PB緩沖液中，在300W條件下超聲破碎20min，每破碎1s間隔1s，即得到細胞破碎懸液；細胞破碎懸液12000rpm 4℃下離心10min，上清液即是粗酶液；取粗酶液上樣至預平衡Ni-NTA金屬螯合親和層析柱中，使用AKTA蛋白純化儀依次用含5mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、150mM、250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白；收集150mM咪唑PBS緩沖液的流出液，獲得目的蛋白并用pH 8.0、50mM Tris-HCl緩沖液通過超濾濃縮脫鹽，所得的脫鹽酶液即是酯酶PAE的純酶液。

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述含SEQ ID NO.1所示酯酶PAE基因的工程菌是將SEQ ID NO.1所示酯酶PAE基因連接到載體pAEASY-blunt-E1上，導入E.coli BL-21(DE3)感受態(tài)中表達，構(gòu)建基因工程菌E.coli BL-21(DE3)/pAEASY-blunt-E1。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述脂肪酶為固定化脂肪酶Novozym TLIM、固定化脂肪酶Novozym 435、固定化脂肪酶Lipase PS-IM、固定化脂肪酶Lipozyme RM、固定化脂肪酶CALB。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸與脂肪酶質(zhì)量比為1：0.05-1；所述水的添加量以(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸質(zhì)量計為0.1-1.0ml/g；所述正己烷的添加量以(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸質(zhì)量計為4-12ml/g；所述無水甲醇體積用量以(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸質(zhì)量計為1-5ml/g。