[發明專利]一種敲減PKR的Marc-145細胞系

有效

• 申請號: 202110966613.0
• 申請日: 2021-08-23
• 公開（公告）號: CN113699150B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 肖躍強;楊慧;王文秀;魏鳳;唐娜;李峰;沈志強
• 申請（專利權）人: 山東省濱州畜牧獸醫研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10;A61K35/22;A61P31/14;A61P31/22
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 牛芳

本發明屬于分子生物學和細胞生物學領域，具體涉及一種PKR基因敲減Marc?145細胞系。本發明提供了一種利用RNAi敲減PKR基因的siRNA的正向和反向序列如SEQ ID NO:1?2所示；shRNA的序列如SEQ ID NO:3所示。將含如SEQ ID NO:3所示目的基因序列的表達載體轉染Marc?145細胞系，篩選后可獲得能夠穩定遺傳的PKR蛋白表達量降低的細胞系：Marc?145∧143，該細胞系中PKR蛋白表達量降低不低于90%。該siRNA、shRNA或Marc?145∧143細胞系可用于生產預防或治療NDV、PRRSV或PRV的藥劑或疫苗。

技術領域

本發明屬于分子生物學和細胞生物學領域，具體涉及一種PKR基因敲減Marc-145細胞系。

背景技術

干擾素誘導的雙鏈RNA激活的蛋白激酶（interferon-induced, double-stranded（ds）RNA-activated kinase，PKR）是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，它能夠被細胞、病毒的雙鏈RNA（dsRNA）或合成類似物（例如polyI：C）激活，在宿主抗病毒防御過程中發揮重要作用。其抗病毒活性主要通過單體PKR與病毒復制過程中產生的雙鏈RNA（dsRNA）結合，形成二聚體并發生自身磷酸化，之后催化其底物-真核生物翻譯起始因子2α（alpha subunit of theeukaryotic initiation factore，eIF2α）磷酸化，導致病毒蛋白的合成受到抑制，從而產生抗病毒作用。

有研究表明^[1]，以siRNA轉染下調Hela細胞PKR的表達能夠促進雞新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）的增殖，轉染重組質粒上調PKR的表達，NDV的增殖受到明顯的抑制。

Xiao Y等^[2]研究揭示，PRRSV在感染豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolarmacrophage，PAM）早期通過抑制PKR活性從而促進自身的增殖。Marc-145細胞是支持豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）體外復制增殖的重要細胞系，克隆自MA-104細胞系，是源于長尾黑顎猴（Cercopithecus aethiops）的一種腎細胞系。Wang X等^[3]研究PRRSV在Macr-145細胞感染研究時，病毒感染12~24 h能夠短暫的活化PKR，并且在病毒感染前，細胞轉染PKR基因小干擾RNA（smallinterfering RNA，siRNA），與對照相比，PRRSV基因轉錄、蛋白合成、增殖滴度均降低，說明PKR促進了PRRSV在Marc-145細胞的增殖，但沒有進行細胞系構建并開展相關研究?？梢姡琍RRSV在天然宿主細胞PAM及體外培養初代細胞Marc-145增殖過程中，PKR發揮了不盡相同的作用。

豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染宿主細胞范圍比較廣，有研究揭示^[4]，當PRV感染MDBK（牛腎細胞）時，PKR與PKR樣內質網激酶（PKR-like ER kinase，PERK）的表達均下降，以PKR抑制劑2-氨基嘌呤處理病毒感染的細胞，蛋白表達能夠部分恢復； XuS等^[5]研究揭示，PRV感染PK-15細胞時，在感染早期PKR被活化，感染晚期其活性受到PRV蛋白的抑制，并且在感染早期，PRV感染Vero細胞時能夠抑制eIF2α的磷酸化，然后促進自身的增殖，而eIF2α的磷酸化是由PRV感染后活化的PERK介導的?？梢姡琍KR理論上對PRV的增殖有可能產生抑制作用。

參考文獻：