[發明專利]一種快速高效的花椒轉基因方法

有效

• 申請號: 202110964693.6
• 申請日: 2021-08-19
• 公開（公告）號: CN113667690B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 費希同;魏安智;王姝潔
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/78;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京圣州專利代理事務所(普通合伙) 11818
• 代理人: 劉巖

本發明公開了一種快速高效的花椒轉基因方法，花椒轉基因高效遺傳轉化包括如下步驟：(1)植物材料準備；(2)侵染菌體準備；(3)侵染；(4)延長培養；(5)篩選培養；(6)鑒定陽性芽；(7)轉基因成苗。本發明采用上述的一種快速高效的花椒轉基因方法，能夠有效地轉移特定優良性狀，快速高效地選育花椒新品種。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，尤其是涉及一種快速高效的花椒轉基因方法。

背景技術

花椒屬蕓香科花椒屬植物，耐干旱瘠薄，根系發達，適應性強，因其極高的經濟價值和生態價值，被認為是我國主要的生態綠化樹種之一。除生態價值外，花椒還是我國重要的調味品、香料及木本油料樹種，具有很高的利用價值。在生產實踐中人們需要在提高花椒產量、降低采摘難度、提高樹種抗性和改良品質等方面進行改良，藥用或食用等產品加工上也需要特異性改變某些物質的含量，因此，花椒屬植物的育種工作有必要長期而持續地進行。

我國花椒種質資源十分豐富，大量的生態地理變型和無融合生殖導致的較高遺傳穩定性為花椒的育種工作奠定了物質和理論基礎。目前花椒的遺傳改良主要依靠自然變異，但變異率低及變異的不確定性，使得花椒種質創新和良種繁育工作一直沒有取得突破性進展。雖已有一些花椒人工育成品種，但遠不能滿足生產的需求。因而開辟花椒育種新途徑具有重大研究意義。

傳統育種技術對新品種的培育受限于種內與種間雜交隔離，很多重要的性狀無法通過常規育種方法進行改良。且傳統育種技術耗時較長，效率較低。與之相比，轉基因技術具有高效性、精準性等優點，可以縮短育種周期，解決雜交育種可能出現的問題，更有效地轉移優良性狀，培育具有產量高、果粒大、高精油、高抗性、藥用價值高、無刺的花椒新品種，創造出花椒優異種質。因此，建立完整的花椒遺傳轉化體系，將優良性狀集中到某一個品系上，是實現花椒種質創新及性狀改良的一個有效途徑。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速高效的花椒轉基因方法，能夠有效地轉移特定優良性狀，快速高效地選育花椒新品種。

為實現上述目的，本發明提供了一種快速高效的花椒轉基因方法，花椒轉基因高效遺傳轉化包括如下步驟：

(1)植物材料準備

將花椒葉片外植體消毒，切成0.5cm×0.5cm的小塊，預培養2d；

(2)侵染菌體準備

在添加卡那霉素的LB培養基上挑取單克隆于10ml LB培養基小搖過夜，然后吸取上述菌液500μL再加50mL LB抗性培養基搖菌過夜；

再于5000r/min離心5min收集菌體，然后用50mL的M20培養基重懸菌體，并控制OD值在0.4-0.6之間；

(3)侵染

28℃100r/min侵染8min；

(4)延長培養

用500mg/LCef頭孢沖洗侵染材料后轉入含有250mg/L Cef的分化培養基，暗培養2d；

(5)篩選培養

再次轉入含有25mg/L kan、250mg/L Cef的分化培養基培養30d；

(6)鑒定陽性芽

(7)轉基因成苗。

優選的，步驟(2)中，LB抗性培養基中添加卡那霉素500mg/L、利福平250mg/L和慶大霉素500mg/L。

優選的，步驟(2)中，M20培養基中含AS乙酰丁香酮和Bet甜菜堿。

優選的，步驟(3)中，侵染后將葉塊用無菌濾紙吸干后轉移至共培養基中，于暗處共培養3d。