[發明專利]一種快速高效的花椒轉基因方法有效
| 申請號： | 202110964693.6 | 申請日： | 2021-08-19 |
| 公開（公告）號： | CN113667690B | 公開（公告）日： | 2023-03-31 |
| 發明（設計）人： | 費希同;魏安智;王姝潔 | 申請（專利權）人： | 西北農林科技大學 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/78;C12Q1/6895 |
| 代理公司： | 北京圣州專利代理事務所(普通合伙) 11818 | 代理人： | 劉巖 |
| 地址： | 712100 陜西省*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 快速 高效 花椒 轉基因 方法 | ||
1.一種快速高效的花椒轉基因方法，其特征在于，花椒轉基因高效遺傳轉化包括如下步驟：
(1)植物材料準備
將花椒葉片外植體消毒，切成0.5cm×0.5cm的小塊，預培養2d；
(2)侵染菌體準備
在添加卡那霉素的LB培養基上挑取單克隆于10mlLB培養基小搖過夜，然后吸取上述菌液500μL再加50mLLB抗性培養基搖菌過夜；
LB抗性培養基中添加卡那霉素500mg/L、利福平250mg/L和慶大霉素500mg/L；
再于5000r/min離心5min收集菌體，然后用50mL的M20培養基重懸菌體，并控制OD值在0.4-0.6之間；
M20培養基中含AS乙酰丁香酮和Bet甜菜堿；
(3)侵染
28℃100r/min侵染8min；侵染后將葉塊用無菌濾紙吸干后轉移至共培養基中，于暗處共培養3d；
共培養基中包括MS培養基、激素、10mmol/LAS、100mmol/LBet；
(4)延長培養
用500mg/LCef頭孢沖洗侵染材料后轉入含有250mg/LCef的分化培養基，暗培養2d；
(5)篩選培養
再次轉入含有25mg/Lkan、250mg/LCef的分化培養基培養30d；
(6)鑒定陽性芽
(7)轉基因成苗。
2.根據權利要求1所述的一種快速高效的花椒轉基因方法，其特征在于：步驟(6)中，待分化培養后長出植株后，取一片葉子提取總RNA，然后根據轉基因序列設計特異性引物進行RT-qPCR鑒定，以未轉化材料為對照，檢測Ct值低于25則為陽性轉基因芽。
3.根據權利要求1所述的一種快速高效的花椒轉基因方法，其特征在于：步驟(7)中，將鑒定后的陽性芽轉移到生根培養基，進行生根處理并最終獲得轉基因植株。
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