[發(fā)明專利]一種單堿基編輯工具TaC9-ABE及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110963044.4
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113774085B
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賴良學(xué);劉洋;鄒慶劍;周繼曾;周小青;楊洋;李川;劉玉;程令印;鄭雨齡
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N9/78;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/90;C12N5/10;A61K31/7088;A61P21/00;A61P7/06;A61P7/04
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 王艷齋

本發(fā)明提供了一種單堿基編輯工具TaC9?ABE及其應(yīng)用。所述單堿基編輯工具TaC9?ABE包括：表達(dá)TALE識別蛋白、野生型腺苷脫氨酶和突變型腺苷脫氨酶的第一載體；表達(dá)SgRNA和nSpCas9蛋白的第二載體。所述單堿基編輯工具TaC9?ABE是一種雙組份基因編輯器，具有高效、安全的特點(diǎn)。相比于傳統(tǒng)的ABE7.10系統(tǒng)，該雙組份編輯器TaC9?ABE的編輯效率與其相似甚至更高。該雙組份編輯器中的單組分在靶向位點(diǎn)完全沒有編輯活性，且雙組份同時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)預(yù)測的脫靶區(qū)域也沒有發(fā)現(xiàn)編輯現(xiàn)象，說明該雙組份編輯器增加了靶向位點(diǎn)的識別特異性，減少了Cas9非特異性結(jié)合導(dǎo)致的DNA脫靶問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單堿基編輯工具TaC9-ABE及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

靶向人類基因組的核苷酸編輯在科學(xué)研究和臨床治療中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。目前，應(yīng)用最廣泛的基因編輯方法是CRISPR/Cas9技術(shù)，它可以在包括哺乳動(dòng)物等在內(nèi)的多種生物細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯，但由于產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)會(huì)通過易錯(cuò)的非同源末端連接(NHEJ)引起隨機(jī)插入缺失，同時(shí)目標(biāo)的同源性定向修復(fù)(HDR)在靶位點(diǎn)效率較低，因此在臨床應(yīng)用方面CRISPR/Cas9技術(shù)存在一定的問題。

同時(shí)，隨著人類基因組計(jì)劃的開展，通過大數(shù)據(jù)分析已經(jīng)證實(shí)與疾病相關(guān)的基因變異約80％屬于點(diǎn)突變，而轉(zhuǎn)換突變(從一個(gè)嘌呤-嘧啶堿基對變成另一嘌呤-嘧啶堿基對)約占已知致病性點(diǎn)突變的60％。

研究證明與催化受損的Cas9蛋白融合的胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶可高效實(shí)現(xiàn)靶向C-to-T(BE3)或A-to-G(ABE7.10)單堿基轉(zhuǎn)換，不產(chǎn)生DSB且不依賴模板供體DNA。這種轉(zhuǎn)換通過CRISPR/Cas9堿基編輯器，RNA引導(dǎo)的Cas蛋白與單鏈DNA(ssDNA)脫氨酶融合來實(shí)現(xiàn)。DNA中的A-T到G-C轉(zhuǎn)換需要將腺苷脫氨為肌苷，而肌苷被細(xì)胞機(jī)制識別為鳥苷。在DNA沒有脫氨基酶的情況下，大腸桿菌tRNA腺苷脫氨酶(TadA)與Cas9融合，并進(jìn)化成ABE7.10，它能催化脫氧腺苷的靶向脫氨。ABE7.10編碼兩個(gè)TadA的副本，一個(gè)N端野生型(WT)TadA連接到進(jìn)化的TadA(TadA*)，它的C端連接到一個(gè)“缺口酶”(即切割雙鏈DNA(dsDNA)的一條鏈)版本的嗜熱鏈球菌Cas9(nSpCas9)。

ABE對研究和校正致病等位基因特別有用，因?yàn)樵瓌t上將A-T堿基對轉(zhuǎn)換為G-C堿基可糾正近一半的致病點(diǎn)突變，因此，單堿基編輯技術(shù)被人們寄予了厚望，相繼成為脊髓性肌營養(yǎng)不良、地中海貧血、血友病等罕見病基因治療的熱門工具之一。

然而，隨著研究的深入進(jìn)行，研究人員發(fā)現(xiàn)單堿基編輯工具的脫靶效應(yīng)明顯。2019年3月通過全基因組測序分析，研究人員分別在小鼠和水稻上證實(shí)，除了傳統(tǒng)的Cas9非特異性結(jié)合導(dǎo)致的DNA脫靶風(fēng)險(xiǎn)之外，CBE系統(tǒng)還存在Cas9非依賴型的DNA脫靶風(fēng)險(xiǎn)，而ABE系統(tǒng)的Cas9非依賴型的DNA脫靶效應(yīng)相對較低。

2019年4月，J.Keith?Joung團(tuán)隊(duì)的研究論文顯示：CBE和ABE單堿基編輯不僅會(huì)導(dǎo)致DNA突變，還會(huì)導(dǎo)致大量RNA編輯。(參見Grünewald?J,Zhou?R,Garcia?SP,Iyer?S,LareauCA,Aryee?MJ,Joung?JK.Transcriptome-wide?off-target?RNA?editing?induced?byCRISPR-guided?DNA?base?editors.Nature.May；569(7756):433-437(2019).)。