[發(fā)明專利]視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110962908.0
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113481160B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張晗
• 申請（專利權(quán)）人: 北京太東生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/079
• 代理公司: 北京華進(jìn)京聯(lián)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11606
• 代理人: 信建

本發(fā)明涉及一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用。該誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包含如下成分的Neurobasal培養(yǎng)基：B27補(bǔ)充劑、L?谷氨酰胺1mM～5mM、丙酮酸鈉0.5mM～3mM、β?巰基乙醇0.05mM～0.15mM、L?抗壞血酸30mM～120μM、cAMP 0.5mM～3mM、BMP抑制劑30nM～120nM、GSK?3β抑制劑5μM～20μM、ALK抑制劑5μM～25μM以及SHH 15ng/ml～60ng/ml。該培養(yǎng)基可由人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為原料定向分化培養(yǎng)得到能夠產(chǎn)生多巴胺的多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

帕金森病是老年人群中最常見的神經(jīng)退行性疾病之一。帕金森病患者通常患有靜息震顫、僵硬、運動功能減退、步態(tài)、平衡和自主功能障礙、抑郁癥和癡呆癥。從病因?qū)W的角度來看，帕金森病是由黑質(zhì)致密部產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元丟失引起的黑質(zhì)-紋狀體神經(jīng)元投射是疾病期間運動癥狀的原因。從中腦多巴胺神經(jīng)元的改變開始，這種疾病最終會影響前腦神經(jīng)元，如皮質(zhì)神經(jīng)元。在過去十年中，已經(jīng)確定了幾個易感性因素。這研究表明，蛋白質(zhì)錯誤折疊、氧化應(yīng)激異常增加、線粒體功能障礙以及泛素-蛋白酶體和自噬-溶酶體系統(tǒng)的損傷都可能導(dǎo)致帕金森病的發(fā)展。

帕金森病患者目前接受多種藥物治療，包括左旋多巴、多巴胺激動劑和單胺氧化酶B抑制劑。其中，左旋多巴是最有效的藥物，但經(jīng)常觀察到不希望的副作用，包括PD癥狀的波動和運動障礙。雙側(cè)丘腦底核或蒼白球中間核(GPi)深部腦刺激(DBS)可改善患者的病情，減少其左旋多巴的每日劑量，并改善左旋多巴相關(guān)的運動并發(fā)癥和運動障礙。盡管如此，據(jù)報道DBS會導(dǎo)致嚴(yán)重的抑郁癥。盡管癥狀管理有所改善，但所有這些療法都不能阻止疾病的發(fā)展。希望通過替換患病的神經(jīng)元來阻止疾病的發(fā)展，細(xì)胞療法已經(jīng)在臨床試驗中用于治療患有帕金森病的動物或帕金森病患者。在這方面，胎兒來源的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是第一個被研究的細(xì)胞類型，其次是間充質(zhì)干細(xì)胞、從胚胎干細(xì)胞(ES)分化而來的多巴胺能神經(jīng)元和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)。然而，安全性問題、倫理問題和過度移植細(xì)胞中多巴胺產(chǎn)生的能力限制了帕金森病患者的臨床應(yīng)用。為了尋找帕金森病治療的替代細(xì)胞來源，一項使用人胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的開放標(biāo)記先導(dǎo)研究報告稱，移植后12個月內(nèi)觀察到，該研究能夠改善患者的狀況。然而，一項使用相同視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的隨機(jī)雙盲研究沒有證實相同的治療效果。此外，在臨床使用胎兒組織方面仍存在倫理問題。

本發(fā)明的發(fā)明人此前曾經(jīng)進(jìn)行過誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究，但所采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法仍然存在多巴胺產(chǎn)量不高的問題。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其為包含如下成分的Neurobasal培養(yǎng)基：

B27補(bǔ)充劑、L-谷氨酰胺1mM～5mM、丙酮酸鈉0.5mM～3mM、β-巰基乙醇0.05mM～0.15mM、L-抗壞血酸30mM～120μM、cAMP 0.5mM～3mM、BMP抑制劑30nM～120nM、GSK-3β抑制劑5μM～20μM、ALK抑制劑5μM～25μM以及SHH 15ng/ml～60ng/ml。

可選的，如上所述的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其為包含如下成分的Neurobasal培養(yǎng)基：

B27補(bǔ)充劑、L-谷氨酰胺2mM～4mM、丙酮酸鈉1mM～2mM、β-巰基乙醇0.05mM～0.15mM、L-抗壞血酸50mM～100μM、cAMP 1mM～2mM、BMP抑制劑50nM～100nM、GSK-3β抑制劑10μM～15μM、ALK抑制劑10μM～20μM以及SHH 20ng/ml～50ng/ml。

可選的，如上所述的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述B27補(bǔ)充劑的添加量為所述Neurobasal培養(yǎng)基體積的1/60～1/40。