[發明專利]檢測半滑舌鰨TLR2和NF-κB基因表達水平的引物及方法

在審

• 申請號: 202110962603.X
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113444781A
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 汪笑宇;邵蓬;湯青平;賈磊;王群山;劉克明;何曉旭
• 申請（專利權）人: 天津市水產研究所;天津農學院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明公開了一種用于非診斷目的檢測半滑舌鰨TLR2和NF?κB基因表達水平的實時熒光定量PCR的引物，所述引物包括半滑舌鰨TLR2和NF?κB基因的特異性上、下游引物。本發明引物能夠實現對半滑舌鰨TLR2和NF?κB基因的特異性擴增，對材料中非目的基因沒有擴增信號，可對半滑舌鰨TLR2和NF?κB基因表達水平的變化情況實施定量檢測，其操作簡單，可重復性高，特異性強，靈敏度好，無需使用熒光探針，檢測過程準確高效，應用前景廣闊。能夠檢測半滑舌鰨TLR2和NF?κB基因的表達水平，為TLR2和NF?κB基因的功能研究奠定基礎。

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，是一種檢測半滑舌鰨TLR2和NF-κB基因表達水平的實時熒光定量PCR的引物及方法。

背景技術

TLR2是Toll樣受體(Toll-liκe receptors，TLR)家族的一員，可以識別來源于微生物的保守分子結構，當微生物突破機體的物理屏障時，TLR可以識別它們并激活機體產生免疫細胞應答，在機體的天然免疫防御中起重要作用。TLR2具有廣泛的從病毒到寄生生物的識別譜，可識別革蘭氏陽性菌的肽聚糖和脂磷壁酸，革蘭氏陰性菌細胞壁的脂蛋白和脂肽聚糖，革蘭氏陰性菌、螺旋菌和支原體細胞膜的脂蛋白和脂肽，霉菌的細胞壁成分，真菌的酵母聚糖，某些寄生生物，原生動物細胞膜的糖脂及病毒等。其最突出的生物學功能就是直接或間接地促進炎癥因子的合成與釋放，具有顯著的抗菌抗病毒作用。因此，TLR2基因的表達水平能夠間接地反應出魚體是否受到微生物的外來刺激，是否誘導了免疫應答的發生。

NF-κB基因在魚類先天性免疫應答中發揮重要的調控作用，控制機體多條重要的免疫信號通路，產生免疫效應因子來抵御外界的病原刺激，因此其調節表達與微生物感染和免疫刺激有關。研究其在魚類中的表達情況，將有利于進一步闡明魚類對病原刺激的免疫應答模式，為深入了解魚類的先天性免疫奠定基礎。

文獻報道多集中在人或果蠅、小鼠等模式生物的TLR2和NF-κB基因的研究，其在魚類上的免疫應答模式尚未探究清楚，那么建立一種可靠的、高效的基因表達水平檢測方法就具有重要意義。

通過檢索，尚未發現與本發明專利申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種用于非診斷目的檢測半滑舌鰨TLR2和NF-κB基因表達水平的實時熒光定量PCR的引物，所述引物包括半滑舌鰨TLR2和NF-κB基因的特異性上、下游引物；

其中，半滑舌鰨TLR2基因的特異性上、下游引物序列如下：

TLR2 F：SEQ ID NO.1：TGTTACGGTTTGACTGGCGT

TLR2 R：SEQ ID NO.2：AAGATTGGGCATGTAGCCCC

半滑舌鰨NF-κB基因的特異性上、下游引物序列如下：

NF-κB F：SEQ ID NO.3：AGCTACGAGGTCTCAGGAGG

NF-κB R：SEQ ID NO.4：CCTCTACAGTGGAGCCTTGC

一種利用上述引物組用于非診斷目的檢測半滑舌鰨TLR2和NF-κB基因表達水平的實時熒光定量PCR的方法，步驟如下：

(1)逆轉錄合成得到半滑舌鰨肝臟組織cDNA第一鏈；

(2)分別以TLR2 F和TLR2 R、NF-κB F和NF-κB R為引物，用實時熒光定量PCR法檢測TLR2和NF-κB基因的表達水平；

進一步地，所述步驟(1)具體為：

以半滑舌鰨組織的總RNA(500ng左右)為模板，逆轉錄合成得到半滑舌鰨組織cDNA第一鏈。