[發(fā)明專(zhuān)利]一種變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶缺失突變株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110961082.6
• 申請(qǐng)日: 2021-08-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113637622A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫文敬;王家皓;孫雷;周強(qiáng);崔鳳杰;余泗蓮;王大明;昝新藝;齊向輝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇大學(xué);江西省德興市百勤異VC鈉有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/61;C12N15/78;C12P7/60;C12R1/38
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發(fā)明提供了一種變形假單胞菌2?酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶缺失突變株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以變形假單胞菌JSU01為基礎(chǔ)菌株，敲除2?酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶的全部編碼序列或部分編碼序列得到突變株JSU01ΔkguE。通過(guò)敲除2?酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶，使獲得的突變株對(duì)2KGA的分解代謝速率顯著降低，而在2KGA發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)特性沒(méi)有明顯改變，表明2?酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶是2KGA分解代謝過(guò)程中具有重要作用的酶，且所述酶存在與2KGA分解代謝呈正相關(guān)。所述的突變株JSU01ΔkguE具有更為優(yōu)良的2KGA發(fā)酵生產(chǎn)性能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶缺失突變株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

2-酮基葡萄糖酸(2-ketogluconic acid,2KGA)又稱2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid)，目前主要用作生產(chǎn)食品添加劑D-異抗壞血酸及其鹽類(lèi)的前體，也可作為雜環(huán)化合物合成、區(qū)域選擇性和立體選擇性化學(xué)反應(yīng)中的基礎(chǔ)材料。

發(fā)酵法是目前最為經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)境友好的2KGA工業(yè)生產(chǎn)方法。2KGA發(fā)酵通常利用假單胞菌(Pseudomonas)、葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter)、歐文氏菌(Erwinia)、醋酸桿菌(Acetobacter)或沙雷氏菌(Serratia)，其中在國(guó)際上得到普遍使用的為假單胞菌。變形假單胞菌(P.plecoglossicida)JSU01是一株能夠在高濃度葡萄糖存在的條件下迅速生長(zhǎng)、高效合成2KGA菌株，是迄今為止國(guó)際上報(bào)道的2KGA合成效率最高的菌株之一，已成為我國(guó)2KGA發(fā)酵生產(chǎn)的主要工業(yè)用菌。目前，變形假單胞菌JSU01已于2013年1月18日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心中，保藏編號(hào)為CGMCC No.7150。

假單胞菌利用葡萄糖作為碳源時(shí)，2KGA的合成與分解代謝過(guò)程是同時(shí)存在的，即在2KGA發(fā)酵過(guò)程中，2KGA既是發(fā)酵目的產(chǎn)物，也是可被其生產(chǎn)菌株利用的中間代謝產(chǎn)物。這種現(xiàn)象的存在，客觀上不利于提高2KGA發(fā)酵生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，同時(shí)也給其發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程控制帶來(lái)了一些不確定的因素。因此，如何有效降低發(fā)酵液中的2KGA被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)進(jìn)而被代謝利用成為進(jìn)一步提升2KGA發(fā)酵水平的技術(shù)難題。

在假單胞菌中，與2KGA分解代謝相關(guān)的基因位于染色體上的2KGA利用操縱子(kgu操縱子)中。kgu操縱子的結(jié)構(gòu)基因包括kguT、kguK、kguE和kguD，分別編碼2-酮基葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(KguT)、2-酮基葡萄糖酸激酶(KguK)、2-酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶(KguE)和2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸還原酶(KguD)。其中：KguT是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⒅苜|(zhì)空間或培養(yǎng)環(huán)境中的2KGA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中；KguK是一種ATP依賴性激酶，在ATP存在的條件下能夠?qū)?KGA磷酸化為2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸；KguD是一種NADPH依賴性還原酶，能夠?qū)?-酮基-6-磷酸葡萄糖酸還原為中心代謝產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖酸。KguE是一種與假單胞菌2KGA分解代謝相關(guān)的異構(gòu)酶，但到目前為止，KguE在2KGA代謝中的作用尚未得到明確的闡釋。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶缺失突變株(JSU01ΔkguE)，減少假單胞菌2KGA發(fā)酵過(guò)程中2KGA的分解代謝，具有更為優(yōu)良的2KGA發(fā)酵生產(chǎn)性能。

本發(fā)明的目的還在于提供變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶缺失突變株在2KGA發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，有利于減少假單胞菌2KGA發(fā)酵過(guò)程中2KGA的分解代謝，從而提高2KGA的產(chǎn)量。

本發(fā)明提供了一種變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶缺失突變株JSU01ΔkguE，以變形假單胞菌JSU01為基礎(chǔ)菌株，敲除2-酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶的全部編碼序列或部分編碼序列。

優(yōu)選的，敲除的2-酮基葡萄糖酸差向異構(gòu)酶的全部編碼序列如SEQ ID NO:1所示。