[發明專利]一種變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶缺失突變株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110961082.6
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113637622A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 孫文敬;王家皓;孫雷;周強;崔鳳杰;余泗蓮;王大明;昝新藝;齊向輝
• 申請（專利權）人: 江蘇大學;江西省德興市百勤異VC鈉有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/61;C12N15/78;C12P7/60;C12R1/38
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

1.一種變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶缺失突變株JSU01ΔkguE，其特征在于，以變形假單胞菌JSU01為基礎菌株，敲除2-酮基葡萄糖酸差向異構酶的全部編碼序列或部分編碼序列。

2.根據權利要求1所述變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶缺失突變株JSU01ΔkguE，其特征在于，敲除的2-酮基葡萄糖酸差向異構酶的全部編碼序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根據權利要求1所述變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶缺失突變株JSU01ΔkguE，其特征在于，敲除的2-酮基葡萄糖酸差向異構酶的部分編碼序列如SEQ ID NO:2所示。

4.權利要求1～3任意一項所述變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶缺失突變株JSU01ΔkguE的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)以變形假單胞菌JSU01的基因組DNA為模板，用引物P1、引物P2進行PCR擴增，得到kguE基因的上游同源臂片段；

2)以變形假單胞菌JSU01的基因組DNA為模板，用引物P3、引物P4進行PCR擴增，得到kguE基因的下游同源臂片段；

3)以步驟1)中所述kguE基因的上游同源臂片段和步驟2)中所述kguE基因的下游同源臂片段為模板，用引物P1和P4進行重疊PCR擴增，得到融合片段ΔkguE；

4)將所述融合片段ΔkguE和質粒用BamH I和Hind III進行雙酶切處理，得到雙酶切產物進行連接，得到攜帶融合片段ΔkguE的重組載體；

5)將步驟4)中所述攜帶融合片段ΔkguE的重組載體轉化到變形假單胞菌JSU01的感受態細胞中，得到重組菌株JSU01ΔkguE；

其中步驟1)與步驟2)之間沒有時間順序的限制。

5.根據權利要求4所述構建方法，其特征在于，步驟1)中引物P1的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根據權利要求4所述構建方法，其特征在于，步驟2)中引物P3的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

7.根據權利要求4～6任意一項所述構建方法，其特征在于，步驟5)中轉化后，包括陽性菌株的篩選；

所述陽性菌株的篩選的方法是以轉化后的菌株的基因組DNA為模板，采用引物P1和P4進行PCR擴增，PCR擴增產物為1594bp時表明轉化后的菌株為缺失kguE基因的突變株JSU01ΔkguE。

8.權利要求1～3任意一項所述變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶缺失突變株JSU01ΔkguE或權利要求4～7任意一項所述構建方法構建得到的JSU01ΔkguE在2KGA發酵生產中的應用。

9.權利要求1～3任意一項所述變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶缺失突變株JSU01ΔkguE或權利要求4～7任意一項所述構建方法構建得到的JSU01ΔkguE在制備生產2KGA的發酵劑中的應用。

10.一種生產2KGA的發酵劑，其特征在于，包括權利要求1～3任意一項所述變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶缺失突變株JSU01ΔkguE或權利要求4～7任意一項所述構建方法構建得到的JSU01ΔkguE。