[發(fā)明專利]一種花馬雜交鹿鹿角盤活性肽及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110960912.3
• 申請(qǐng)日: 2021-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN113603762B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡薇;汪樹理;周怡君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/47
• 分類號(hào): C07K14/47;C07K1/16;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/36;C07K1/14;A61K38/17;A61P31/04
• 代理公司: 沈陽一諾君科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 21266
• 代理人: 劉麗娟

1.一種6.5kDa以下花馬雜交鹿鹿角盤活性肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、取花馬雜交鹿鹿角盤磨碎成粉末，得到鹿角盤粉；

S2、配制pH為3.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液于4℃中充分預(yù)冷，將醋酸-醋酸鈉緩沖溶液與鹿角盤粉按重量比5：1的比例混合，充分?jǐn)嚢韬箅x心取上清液，記為溶液A；

S3、向溶液A中加入終濃度為55％的乙醇，于4℃下靜置后離心取上清液，記為溶液B；

S4、將溶液B用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃下蒸發(fā)至合適體積，冷凍干燥得總蛋白粗提物；

S5、將總蛋白粗提物用去離子水溶解，然后用SephadexG-25層析柱除鹽，除鹽條件為：上樣量為10ml；上樣濃度為100mg/ml，洗脫液為去離子水，洗脫流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，收集各組分，冷凍干燥后，獲得除鹽蛋白；用BCA法檢測(cè)除鹽蛋白中的蛋白含量，用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白分子量的分布：其大分子蛋白主要集中在116kDa～29.0kDa之間，小分子量蛋白主要集中在20.1kDa以下，其中以20.1kDa和6.5kDa的蛋白尤為明顯；

S6、對(duì)除鹽蛋白進(jìn)行凝膠過濾色譜分析：將50mg的除鹽蛋白溶于2ml的超純水中，配成終濃度為25mg/ml的上樣樣品，用SephadexG-25層析柱以0.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液為去離子水，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，收集兩個(gè)組分S1和S2，冷凍干燥后于-20℃保存，用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)兩個(gè)組分S1和S2的分子量分布：組分S1主要為116kDa-29kDa之間的大分子蛋白，組分S2主要在20kDa和6.5kDa有明顯的兩種蛋白；

S7、反相高效液相色譜分離：取10mg凝膠過濾色譜分離出的組分S2用2ml的乙腈水溶液溶解成終濃度為5mg/ml的上機(jī)樣品，色譜柱為ZORBAX?300SB-C18，流動(dòng)相A為加有0.1％三氟乙酸的超純水，流動(dòng)相B為加有0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，設(shè)置流速為1ml/min，梯度洗脫：乙腈濃度10％-18％，0-5min；18％-40％，5-40min；40％-50％，40-50min；多次收集出現(xiàn)的多個(gè)色譜峰的峰尖液組分，并用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)分子量，收集6.5kDa以下氨基酸序列為EAVLRAVDQFNKR的蛋白S2-1為目標(biāo)蛋白，冷凍干燥收集于-20℃保存即得花馬雜交鹿鹿角盤活性肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的6.5kDa以下花馬雜交鹿鹿角盤活性肽的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中，離心的條件為：于4℃、5000g離心力下離心20min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的6.5kDa以下花馬雜交鹿鹿角盤活性肽的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，離心的條件為：于4℃、5000g離心力下離心20min。

4.一種6.5kDa以下花馬雜交鹿鹿角盤活性肽，其特征在于，使用如權(quán)利要求1-3任一所述的6.5kDa以下花馬雜交鹿鹿角盤活性肽的制備方法制得。