[發明專利]一種G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白及其應用

在審

• 申請號: 202110958760.3
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113563484A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 趙肅清;林明霞;勞志婷;何綺怡;張樂恒;崔錫平
• 申請（專利權）人: 廣東工業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;G01N33/535;G01N33/53
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 王海曼

本發明公開了一種G11?scFv?Nluc雙功能活性的融合蛋白及其應用，旨在提供一種具有較好特異性和信號放大作用融合蛋白，采用該融合蛋白建立超敏的生物發光免疫分析試劑盒，用于檢測尿液中甘膽酸的含量，具有良好的應用價值及前景；所述的G11?scFv?Nluc融合蛋白通過下述方法制備的：以納米熒光素酶作為生物發光的催化劑，將抗甘膽酸單鏈抗體(G11?scFv)與納米熒光素酶融合并克隆到pET22b表達載體中，獲得的屬于免疫檢測技術領域。

技術領域

本發明屬于免疫檢測技術領域，涉及一種融合蛋白，特別涉及一種G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，本發明還涉及G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白的應用。

背景技術

甘膽酸是膽酸與甘氨酸結合而成的結合型膽酸之一，是膽固醇在肝細胞內代謝的產物，其含量的測定對肝病診斷具較敏感性，是評價肝臟功能的一項很重要的指標。甘膽酸作為生物標志物提示甘膽疾病，該小分子的免疫分析檢測為肝臟疾病的診斷、治療和預后分析提供重要依據。相關研究指出，膽汁酸經腎臟排泄很明顯，并與肝膽疾病程度相關，因此檢測尿液中的甘膽酸對臨床有一定指導價值。臨床上檢測甘膽酸多取靜脈血，而針對一些小兒患者、不便于取靜脈血的患者，檢測其尿液中的甘膽酸有著其便利性與對疾病診斷的指導意義。

免疫分析方法中，增強靈敏度是一個不斷的追求。在免疫分析方法中，增強靈敏度是一個不變的追求。為了提高檢驗方法的靈敏度，傳統的ELISA通常與生物素和親霉素、熒光、化學發光等修飾方法相結合。其中，熒光素酶標記技術是一種新型生物反應放大系統，并能與ELISA有機結合。由于熒光素酶具有高靈敏性與特異性，操作簡單，反應迅速等有優勢，目前被應用于快速檢測等科學研究。然而，傳統的熒光素酶在使用過程中還有不足之處，如熒光強度易受PH、離子強度、溫度等因素影響、依賴ATP等，妨礙了其更多的用途。近年來，一種新型納米熒光素酶的出現很好地彌補了傳統熒光素酶身上的缺點。

為了提高檢測方法的穩定與可操作性，本專利開發一種基于納米熒光素酶的免疫分析方法，納米熒光素酶分子量小、不需要ATP、發光效率高、在各個PH、溫度下理化性質均比較穩定等優點，可以作為廣泛地用于免疫分析方法。

發明內容

為了克服現有技術中的缺點和不足之處，本發明的目的在于提供一種G11-scFv-Nluc融合蛋白，該融合蛋白具有較好特異性和信號放大作用。

本發明另一目的在于提供上述G11-scFv-Nluc融合蛋白用于檢測尿液中甘膽酸的含量的應用。

為了解決上述技術問題，本發明提供技術方案是這樣的：

一種G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，所述的G11-scFv-Nluc融合蛋白通過下述方法制備的：

以納米熒光素酶作為生物發光的催化劑，將抗甘膽酸單鏈抗體(G11-scFv)與納米熒光素酶融合并克隆到pET22b表達載體中，獲得的。

進一步的，上述的G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，所述的G11-scFv-Nluc融合蛋白通過下述方法制備的：

(1)G11-scFv-Nluc表達載體的構建：通過PCR技術克隆G11-scFv以及Nluc基因并拼接得到融合基因G11-scFv-Nluc，再經過雙酶切、基因回收、酶連接獲得表達載體pET22b(+)-G11-scFv-Nluc；

(2)G11-scFv-Nluc融合蛋白制備：通過化學轉化法將表達載體轉化到感受態細胞BL21，再培養陽性單克隆細菌，誘導劑誘導表達融合蛋白。

進一步的，上述的G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，步驟(1)所述G11-scFv-Nluc表達載體的構建具體按照以下步驟：

分別以SNF1，SNR1以及SNF2，SNR2為引物分別克隆G11-scFv以及Nluc基因；