[發明專利]一種G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白及其應用

在審

• 申請號: 202110958760.3
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113563484A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 趙肅清;林明霞;勞志婷;何綺怡;張樂恒;崔錫平
• 申請（專利權）人: 廣東工業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;G01N33/535;G01N33/53
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 王海曼

1.一種G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，其特征在于，所述的G11-scFv-Nluc融合蛋白通過下述方法制備的：

以納米熒光素酶Nluc作為生物發光的催化劑，將G11-scFv與納米熒光素酶融合并克隆到pET22b表達載體中，獲得的；

具體為：

分別以SNF1，SNR1以及SNF2，SNR2為引物分別克隆G11-scFv以及Nluc基因；

所述的SNF1引物的DNA序列為：CCGAATTCGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG；

所述的SNR1引物的DNA序列為：ACCGCCGCTGCCGCCACCACCCTGGCCGGCCTGG；

所述的SNF2引物的DNA序列為：GGTGGTGGCAGCGGCGGTATGGTCTTCACACTCGAA；

所述的SNR2的引物DNA序列為：CCGCTCGAGCGCCAGAATGCGTTCGCA；

分別以第一輪產物G11-scFv以及Nluc基因為模板，以SNF1，SNR2為引物進行重疊延伸PCR技術獲得G11-scFv-Nluc；

所述的G11-scFv基因序列如SEQIDNO.1所示；Nluc基因序列如SEQIDNO.2所示。

2.根據權利要求1所述的G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，其特征在于，所述的G11-scFv-Nluc融合蛋白通過下述方法制備的：

（1）G11-scFv-Nluc表達載體的構建：通過PCR技術克隆G11-scFv以及Nluc基因并拼接得到融合基因G11-scFv-Nluc，再經過雙酶切、基因回收、酶連接獲得表達載體pET22b(+)-G11-scFv-Nluc；

（2）G11-scFv-Nluc融合蛋白制備：通過化學轉化法將表達載體轉化到感受態細胞BL21，再培養陽性單克隆細菌，誘導劑誘導表達融合蛋白。

3.根據權利要求2所述的G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，其特征在于，步驟（1）所述G11-scFv-Nluc表達載體的構建具體按照以下步驟：

分別以SNF1，SNR1以及SNF2，SNR2為引物分別克隆G11-scFv以及Nluc基因；

所述的SNF1引物的DNA序列為：CCGAATTCGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG；

所述的SNR1引物的DNA序列為：ACCGCCGCTGCCGCCACCACCCTGGCCGGCCTGG；

分別以第一輪產物G11-scFv以及Nluc基因為模板，以SNF1，SNR2為引物進行重疊延伸PCR技術獲得G11-scFv-Nluc；

所述的SNF2引物的DNA序列為：GGTGGTGGCAGCGGCGGTATGGTCTTCACACTCGAA；

所述的SNR2的引物DNA序列為：CCGCTCGAGCGCCAGAATGCGTTCGCA；

以第二輪PCR將pET22b載體與G11scFv-Nluc基因分別進行XholⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切產物經切膠回收后，再次進行酶連接獲得表達載體pET22b(+)-G11-scFv-Nluc。

4.根據權利要求2所述的G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，其特征在于，步驟（2）所述G11-scFv-Nluc融合蛋白制備具體按照以下步驟：

基于步驟（1）所述的表達載體pET22b(+)-G11-scFv-Nluc，將表達載體全部轉入100uLBL2感受態細胞中，冰浴25min，42℃水浴熱休克90s，然后迅速將其放入冰盒2min；加入700uLLB培養基，37℃振蕩1小時，吸取適量體積均勻涂布到含有抗生素的固體培養基中培養過夜；次日，挑取單克隆細菌進行培養，并送樣進行測序，測序引物為T7，對測序準確陽性單克隆細菌進行擴大培養，并加入IPTG誘導劑進行誘導表達，使用B-per細菌裂解液提取蛋白并通過鎳親和層析柱純化目的蛋白，并通過超濾對蛋白進行濃縮，最后采用SDS-PAGE電泳測定蛋白分子量和純度。

5.權利要求1所述的G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白在制備尿液中甘膽酸檢測抗體的應用。

6.一種檢測甘膽酸生物發光免疫試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的G11-scFv-Nluc雙功能活性的融合蛋白，GCA-OVA、甘膽酸。