[發明專利]超氧化物歧化酶在制備LCDA中的應用及過表達其的基因工程菌

在審

• 申請號: 202110948679.7
• 申請日: 2021-08-18
• 公開（公告）號: CN115710584A
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發明（設計）人: 張明明;劉修才
• 申請（專利權）人: 上海凱賽生物技術股份有限公司;CIBT美國公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/81;C12N1/19;C12P7/6409;C12R1/72;C12R1/74
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 王衛彬;黃益澍

本發明公開了超氧化物歧化酶在制備LCDA中的應用及過表達其的基因工程菌。所述基因工程菌包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的超氧化物歧化酶基因，所述基因工程菌的出發菌為棒狀桿菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅酵母屬(Rhodotroula)、酵母屬(Saccharomyces)或耶氏酵母屬(Yarrowia)。所述過氧化氫酶在用于制備LCDA中，可提高底物的轉化率及產物的產量，并縮短二元酸發酵時間。

技術領域

本發明屬于微生物工程領域，具體涉及超氧化物歧化酶在制備LCDA中的應用及過表達其的基因工程菌。

背景技術

二元酸是α和ω位各有一個羧基的脂肪族二羧酸，分子式為HOOC(CH₂)_nCOOH。根據碳鏈長度的不同，二元酸可分為長鏈二元酸、中鏈二元酸和短鏈二元酸。一般認為n≥7的二元酸屬于長鏈二元酸(LCDA)。長鏈二元酸作為一種重要的單體原料，已被廣泛用于精細化工和醫藥等領域，如合成高性能工程塑料、高等香料、航空潤滑油、高等油漆和粉末涂料、高溫電解質、耐寒性增塑劑和樹脂等。以長鏈二元酸原料合成的材料不僅具有較好的性能、較低的成本及實用價值，并且能夠節省能源、降低對環境的污染。

長鏈二元酸的獲取方式主要有植物油裂解法、化學合成法和微生物發酵法三種。植物油裂解生產二元酸容易受到自然因素的影響，而且難以達到較高的純度水平；化學合成法在合成過程中常常會出現斷鏈的情況，導致無法生產高純單一產品，且合成流程冗長繁瑣，生產成本高，環境污染嚴重。微生物發酵法主要是利用微生物特有的氧化能力和胞內酶作用的特點，在常溫常壓下將長鏈正烷烴兩端的兩個甲基氧化獲得相應碳鏈長度的二元酸產品，其具有環境友好、操作簡便易控以及產品質量高等特點，具有廣闊發展前景和工業價值。

維斯假絲酵母是微生物發酵法生產長鏈二元酸的主要菌株之一。烷烴經過被動擴散或轉運蛋白通道進入細胞后，在微粒體內被細胞色素P450與NADPH-細胞色素P450還原酶共同催化發生α-氧化，生成脂肪醇。隨后，脂肪醇進入細胞質中，依次在脂肪醇氧化酶和脂肪醛脫氫酶的催化作用下逐步氧化成脂肪醛、脂肪酸。微量的一元脂肪酸被分泌到細胞外，大部分的一元酸會再次進入微粒體，在相同的酶系催化下發生ω-氧化，生成α,ω-二羧酸。烷烴代謝產生的部分二元酸和一元酸會被運送進入過氧化物酶體發生β-氧化反應。在過氧化物酶體內，酰基化的脂肪酸被逐步催化，分解為乙酰-CoA或者丙酰-CoA，最后進入TCA循環。

現階段主要從發酵工程優化和優良菌種選育角度研究如何提高轉化率。如有文獻提出在發酵液中加入一定量的H₂O₂可以提高發酵過程中的氧氣供應而不產生較大的毒害作用，進而提高十三碳二元酸的生產(中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術討論會論文摘要集，2001:1)；敲除POX4和POX5基因可以有效阻斷β-氧化途徑，從而顯著提高底物的轉化率(Mol Cell Biol,1991,11(9),4333-4339)；向二元酸生產菌株中引入一個拷貝的CYP52A14基因有效提高二元酸的轉化率(中國發明專利CN103992959B)。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是生物體內存在的一種抗氧化金屬酶，它具有清除氧化脅迫因素(氧自由基)的功能，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。SOD早在1930年被發現，1969年被正式命名為超氧化物歧化酶。

目前雖然有通過隨機誘變或采用基因工程的手段提高二元酸轉化率的案例，但是從抗氧化酶-超氧化歧化酶角度入手改良二元酸生產菌株，提高二元酸轉化率的研究還未見報道。

發明內容