[發(fā)明專利]一種利用高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌含量的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110946191.0
• 申請(qǐng)日: 2021-08-18
• 公開（公告）號(hào): CN113430256A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張秋芳;黃衛(wèi)紅;黃兆斌;吳寶川;袁建軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 泉州師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/06
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明公開了一種利用高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌含量的方法，包括以下步驟：（1）采集土壤樣品，分離得到可培養(yǎng)細(xì)菌，對(duì)土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，將DNA序列與細(xì)菌屬水平下的已知物種DNA序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定出土壤中屬水平下的可培養(yǎng)細(xì)菌的物種名稱；（2）提取同一土壤樣品中的基因組DNA進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子的高通量測(cè)序，分析土壤細(xì)菌屬水平下的物種組成；（3）篩選出屬水平下可培養(yǎng)細(xì)菌與高通量測(cè)序所得的相對(duì)應(yīng)的細(xì)菌物種，并進(jìn)行同源性分析；（4）獲得（3）中同源性大于97%的土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌物種在高通量測(cè)序結(jié)果中的含量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌含量的方法。

背景技術(shù)

土壤細(xì)菌系統(tǒng)極為龐大，種類繁多，對(duì)土壤中的有機(jī)物、氮、磷和鉀等循環(huán)和轉(zhuǎn)化具有重要作用，同時(shí)也含有土傳病害。以往對(duì)土壤微生物的研究表明，實(shí)驗(yàn)室條件可純培養(yǎng)的土壤細(xì)菌種類較少，而且獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌在整個(gè)土壤細(xì)菌系統(tǒng)中所占比例較小。但是一些可培養(yǎng)細(xì)菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中可能發(fā)揮著主要功能或可能存在潛在的危害。通過了解土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的含量和組成比例，為探究可培養(yǎng)細(xì)菌在土壤系統(tǒng)中的生態(tài)功能作用和危害提供依據(jù)。

現(xiàn)在關(guān)于研究土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量和含量的方法較少。申請(qǐng)?zhí)枮?01010560939.5的專利文件，通過結(jié)合土壤含水量、土壤懸浮液的稀釋度和培養(yǎng)皿中生長的菌落數(shù)計(jì)算土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的數(shù)量。但是該方法只能通過菌落數(shù)計(jì)算得到可培養(yǎng)微生物在土壤中的數(shù)量，而無法分析可培養(yǎng)微生物在土壤中的含量和組成比例；其次該方法在測(cè)定土壤含水量和菌落計(jì)數(shù)過程極為繁瑣，而且在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟中容易產(chǎn)生較大的實(shí)驗(yàn)誤差，尤其對(duì)于菌落計(jì)數(shù)過程。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，首先利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的物種進(jìn)行鑒定，其次使用16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤細(xì)菌的物種組成。篩選出屬水平下高通量測(cè)序所得的細(xì)菌與可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)應(yīng)的物種，并分析其與可培養(yǎng)細(xì)菌物種的同源性，進(jìn)一步確定二者為相同物種。最后分析土壤中屬水平下可培養(yǎng)細(xì)菌物種的含量。本方法的優(yōu)勢(shì)在于操作步驟簡(jiǎn)便快捷，能夠準(zhǔn)確的分析出可培養(yǎng)細(xì)菌在土壤細(xì)菌系統(tǒng)中的含量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌含量的方法。該方法能夠快速檢測(cè)出土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的含量，準(zhǔn)確地分析出土壤細(xì)菌系統(tǒng)中所含可培養(yǎng)細(xì)菌的組成比例。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌含量的方法，包括以下步驟：

（1）采集土壤樣品，經(jīng)過培養(yǎng)分離獲得土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌，通過16S rRNA基因測(cè)序和序列比對(duì)，鑒定出土壤中屬水平下的可培養(yǎng)細(xì)菌的物種種類；

（2）提取與（1）中同一土壤樣品的基因組DNA，利用16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤中總細(xì)菌屬水平下的物種組成；

（3）篩選出屬水平下高通量測(cè)序所得細(xì)菌與可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)應(yīng)的物種，分析二者的同源性，相似度大于97%的即為相同細(xì)菌物種；

（4）在高通量測(cè)序分析平臺(tái)上分析屬水平下土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌物種的含量。

上述步驟（1）中所述的經(jīng)過培養(yǎng)分離獲得土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的步驟為：

將10 g去除雜質(zhì)的土壤樣品置于三角瓶中，加入90 mL無菌水的，充分震蕩混勻，制成土壤懸液原液；采用10倍系列稀釋法用無菌水依次將土壤懸液原液稀釋至原液的100、1000和10000倍；吸取各稀釋梯度的土壤懸液100 μL，用涂布棒均勻涂布到LB培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18~24小時(shí)；待平板上長出單菌落后繼續(xù)將單菌落轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，將單菌落重復(fù)轉(zhuǎn)接3次后獲得純化的可培養(yǎng)細(xì)菌菌株。

上述步驟（1）中所述鑒定土壤中屬水平下的可培養(yǎng)細(xì)菌物種的步驟為：