[發明專利]一種利用高通量測序技術分析土壤中可培養細菌含量的方法

在審

• 申請號: 202110946191.0
• 申請日: 2021-08-18
• 公開（公告）號: CN113430256A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 張秋芳;黃衛紅;黃兆斌;吳寶川;袁建軍
• 申請（專利權）人: 泉州師范學院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/06
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種利用高通量測序技術分析土壤中可培養細菌含量的方法，其特征在于：包括以下步驟：

采集土壤樣品，經過培養分離獲得土壤中的可培養細菌，通過16S rRNA基因測序和序列比對，鑒定出土壤中屬水平下的可培養細菌的物種種類；

（2）提取與（1）中同一土壤樣品的基因組DNA，利用16S rRNA基因高通量測序技術分析土壤中總細菌屬水平下的物種組成；

（3）篩選出屬水平下高通量測序所得細菌與可培養細菌對應的物種，分析二者的同源性，相似度大于97%的即為相同細菌物種；

（4）在高通量測序分析平臺上分析屬水平下土壤中可培養細菌物種的含量。

2.根據權利要求1所述的一種利用高通量測序技術分析土壤中可培養細菌含量的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的經過培養分離獲得土壤中可培養細菌的步驟為：將10 g的新鮮土壤置于三角瓶中，加入90 mL的無菌水，充分震蕩混勻后，制成土壤懸液原液；采用10倍系列稀釋法，用無菌水依次將土壤懸液原液稀釋至原液的100、1000和10000倍；吸取各稀釋梯度的土壤懸液100 μL，用涂布棒均勻涂布到LB培養基平板上，于恒溫培養箱中在37℃下，倒置培養18~24小時；待平板上長出單菌落后繼續將單菌落轉接到LB培養基平板上進行培養，將單菌落重復轉接3次后獲得了純化的可培養細菌單菌株。

3.根據權利要求1所述的一種利用高通量測序技術分析土壤中可培養細菌含量的方法，其特征在于：上述步驟（1）中所述的鑒定土壤中屬水平下的可培養細菌物種的步驟為：將純化后的單菌落接種到30 mL的LB液體培養基中，在培養溫度為37 ℃和轉速為180 rpm的搖床中培養18~24 小時，獲得細菌培養液后提取其基因組DNA；用16S rRNA基因引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'對DNA進行PCR擴增，取擴增產物送至測序公司進行測序，測序獲得的菌株基因序列用DNAMAN 8.0軟件拼接，將每條拼接的有效序列與NCBI數據庫中屬水平下的已知細菌物種序列進行Blast比對，鑒定土壤中屬水平下的可培養細菌物種。

4.根據權利要求1所述的一種利用高通量測序技術分析土壤中可培養細菌含量的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的鑒定獲得的土壤中屬水平下的可培養細菌物種包括：慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）。

5.根據權利要求1所述的一種利用高通量測序技術分析土壤中可培養細菌含量的方法，其特征在于：步驟（2）中所述的16S rRNA基因高通量測序步驟為：從0.5 g土壤樣品中提取總基因組DNA，用帶有Barcode序列的16S rRNA基因引物338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGTWTCTAA-3'對DNA進行PCR擴增，擴增產物送至測序公司，在Illumina Miseq平臺上測序后，以97%的閾值對序列進行聚類分析，分析土壤中細菌屬水平下的物種組成。

6.根據權利要求1所述的一種利用高通量測序技術分析土壤中可培養細菌含量的方法，其特征在于：步驟（3）中所述的同源性分析步驟為：篩選出屬水平下高通量測序所得細菌與可培養細菌對應的物種，用MEGA 7.0軟件比對其DNA序列與獲得的可培養細菌物種DNA序列的相似度，并用MEGA 7.0軟件的鄰接法構建系統發育樹，高通量測序獲得的細菌DNA序列以97%的閾值對序列進行聚類，認可DNA序列相似度大于97%的為相同物種。

7.權利要求1所述方法在土壤中可培養細菌含量分析中的應用。