[發(fā)明專利]一種通過易錯PCR技術(shù)及高通量篩選提高葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11酶活方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110942269.1
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113584016A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 祁飛;劉瑞敏;張真真
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽金禾實業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 安徽省蚌埠博源專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 34113
• 代理人: 倪波

本發(fā)明提供一種易錯PCR技術(shù)及高通量篩選提高葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11酶活的方法，包括以下步驟：a.EUGT11易錯PCR擴增;b.易錯PCR突變體庫構(gòu)建;c.高通量篩選酶活提高突變菌株；d.高酶活突變菌株序列分析。實現(xiàn)對大腸桿菌表達的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11基因進行定向進化，篩選得到提高葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11酶活及可溶表達量的關(guān)鍵堿基突變位點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明本發(fā)明提供一種易錯PCR技術(shù)及高通量篩選提高葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11酶活的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甜菊糖甙（俗稱甜菊糖、甜菊糖苷）是一種從菊科草本植物甜葉菊（或稱甜菊葉）中精提的新型天然甜味劑，而南美洲使用甜葉菊作為藥草和代糖已經(jīng)有幾百年歷史。甜菊糖甙是天然低熱量甜味劑。甜菊糖的熱值僅為蔗糖的1/300,攝入人體后不被吸收,不產(chǎn)生熱量,是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。甜菊糖與蔗糖果糖或異構(gòu)化糖混用時,可提高其甜度,改善口味。可用于糖果、糕點、飲料、固體飲料、油炸小食品、調(diào)味料、蜜餞。國際甜味劑行業(yè)的資料顯示，甜菊糖甙已在亞洲、北美、南美洲和歐盟各國廣泛應(yīng)用于食品、飲料、調(diào)味料的生產(chǎn)中。

甜菊糖苷類化合物組分眾多，均具有四環(huán)二萜母核并且有不同程度的糖基化修飾，從而有不同程度的甜味口感。目前甜菊糖苷類化合物中甜菊苷（Stevioside,ST）、萊鮑迪苷A（RA）在甜葉菊中含量相對豐富，都具有高甜度，但口感上存在后苦味，相比之下萊鮑迪苷D（RD）具有更好的口感特征。甜葉菊中RD含量低，僅占干葉重0.5%左右，從甜葉菊中分離提純產(chǎn)量低生產(chǎn)成本高，無法滿足市場需求。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11在UDPG存在條件下能夠催化RA生成RD。已構(gòu)建的原始EUGT11大腸桿菌表達菌株酶活較低，EUGT11酶可溶表達量低。

易錯PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調(diào)整反應(yīng)條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運用低保真度DNA聚合酶等，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機突變體。其關(guān)鍵在于對合適突變頻率的選擇，突變頻率太高會導(dǎo)致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔儯瑹o法篩選到有益突變;突變頻率太低則會導(dǎo)致文庫中全是野生型群體。理想的堿基置換率和易錯的最佳條件主要依賴于突變的DNA片段的長度。

通常，經(jīng)一次突變的基因很難獲得滿意的結(jié)果，由此發(fā)展出連續(xù)易錯PCR(sequentialerror-pronePCR)策略。即將一次擴增得到的有益突變基因作為下一次擴增的模板，連續(xù)反復(fù)地進行隨機誘變，使每一次擴增得到的正向突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了提高大腸菌株表達葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11酶活，實現(xiàn)RA到RD的高效轉(zhuǎn)化，提供一種通過易錯PCR技術(shù)及高通量篩選提高葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11酶活方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種通過易錯PCR技術(shù)及高通量篩選提高葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11酶活方法，其特征在于包括如下步驟：

a.EUGT11易錯PCR擴增;以實驗室構(gòu)建好的PET30a-EUGT1質(zhì)粒為模板，用引物EP-BsaI-FGAGGTCTCTACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGC和EP-BsaI-RATGGTCTCGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCA進行易錯PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠純化回收目的條帶。

b.易錯PCR突變體庫構(gòu)建;純化后的產(chǎn)物與載體PET30a進行Goldengate連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，涂布于固體LB平板(50μg/mLKana)抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，所有轉(zhuǎn)化子構(gòu)成易錯PCR突變體庫。