[發明專利]一種通過易錯PCR技術及高通量篩選提高葡萄糖基轉移酶EUGT11酶活方法

在審

• 申請號: 202110942269.1
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113584016A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 祁飛;劉瑞敏;張真真
• 申請（專利權）人: 安徽金禾實業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 安徽省蚌埠博源專利商標事務所(普通合伙) 34113
• 代理人: 倪波

1.一種易錯PCR技術及高通量篩選提高葡萄糖基轉移酶EUGT11酶活方法，其特征在于包括以下步驟：

a.EUGT11易錯PCR擴增;以實驗室構建好的PET30a-EUGT1質粒為模板，用引物EP-BsaI-FGAGGTCTCTACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGC和EP-BsaI-RATGGTCTCGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCA進行易錯PCR擴增，PCR擴增產物經質量分數為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠純化回收目的條帶；

b.易錯PCR突變體庫構建;純化后的產物與載體PET30a進行Goldengate連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態，涂布于固體LB平板(50μg/mLKana)抗性篩選陽性轉化子，所有轉化子構成易錯PCR突變體庫；

c.高通量篩選酶活提高突變菌株；從LB平板上挑選單個克隆子菌落接種于含有1mLLB培養基(內含50μg/mLKana)的96孔板中，每孔對應一特定轉化子，每塊96孔板同時接種野生型克隆，作為陽性對照，37°C、220r/min振蕩培養16h，在無菌條件下，從96孔板中取出100μL菌液，轉接至1mLLB培養基(內含50μg/mLKana)的96孔板中，37°C、220r/min培養3h添加IPTG誘導劑，16℃、220r/min振蕩培養18h，離心收菌，酶活測定反應液重懸菌體，37°C、180r/min反應24h，制樣，HPLC檢測RA轉化率，，以陽性對照為參考，將RA轉化率高于陽性對照的克隆挑出；

d.高酶活突變菌株序列分析；篩選出酶活提高的菌株試管活化，搖瓶誘導培養，菌體超聲破碎,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白表達量變化，用質粒提取試劑盒提取質粒送上海生工測序，進行序列分析，分析突變堿基位點及氨基酸位點對蛋白表達及酶活影響。

2.根據權力要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟a中的易錯反應條件MgCl2：2-10mM；

MnCl2：0-1mM；PCR反應條件如下：

。

3.根據權力要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟b中的Goldengate連接，載體與片段摩爾比1：2；反應條件如下：

。

4.根據權力要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟c中酶活測定反應液體系為：0.5mg/mlRA，1mM UDPG,1mg/ml溶菌酶。

5.根據權力要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟d中搖瓶驗證培養基體積為30ml。