[發明專利]一種基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法

有效

• 申請號: 202110941392.1
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113899731B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 方舒婷;周漪波;阮奇珺;向章敏;黃啟紅
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心）
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 莫瑤江;蔣歡妹

本發明公開了一種基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法，包括：(1)合成金納米簇；(2)將核酸適配體通過氫鍵和靜電相互作用與金納米簇結合，得到核酸適配體與金納米簇的復合物；(3)將核酸適配體與金納米簇的復合物置于H₂O₂/TMB顯色體系中；(4)將待測樣品、核酸適配體與金納米簇依次混合孵育并加入H₂O₂/TMB顯色體系中，通過測定加入待測樣品溶液與未加入待測樣品溶液的H₂O₂/TMB顯色體系之間的吸光度差值，建立標準曲線，定量測定樣品溶液中的副溶血性弧菌含量。本發明基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力的差異，利用H₂O₂/TMB顯色體系，可一步檢測副溶血性弧菌，滿足食源性致病菌快速高效檢測的需求。

技術領域

本發明涉及致病菌檢測技術領域，特別是涉及一種基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法。

背景技術

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，V.parahaemolyticus)是一種海洋細菌，主要來源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產品，是常見的食源性致病菌之一。近年來因副溶血性弧菌污染引發的食物安全事件數量不斷上升，因此針對副溶血性弧菌的監測和控制工作亟待加強。

傳統的平板菌落計數法和生理生化鑒定方法是目前檢測致病菌準確且通用的技術，但其最大弱點是耗時費力，具有明顯的滯后性，無法滿足快速監測預警食源性致病菌污染的需要。隨著納米技術、免疫學技術和分子生物學技術不斷進步，國內外研究人員發展了電化學發光免疫傳感器(ECL)、表面增強拉曼散射免疫傳感器(SERS)、多重實時PCR以及環介導等溫擴增技術(LAMP)等新型檢測技術，實現了對致病性微生物的快速檢驗。這些新檢測技術具有靈敏度高、特異性強、可靠性好等優點，但由于檢測過程需要執行復雜的操作以及所采用的設備儀器較為昂貴，難以滿足日常現場檢測的需求，實際應用可行性低。比色生物傳感技術以生成肉眼可見有色化合物的顯色反應為基礎，通過比較或測量有色物質顏色深度來確定待測組分的含量。與上述技術比較，比色生物傳感技術操作簡便、成本低廉、反應時間短、結果可視化，可以滿足現場快速檢測的需要，在實際應用中體現出較好的開發前景。目前比較典型的比色傳感技術主要集中在兩方面：一方面是基于控制金納米顆粒的分散性和聚集性來響應靶標物質識別，例如有現有文獻公開了利用高鹽環境下金納米顆粒發生團聚從而引起溶液顏色變化實現沙門氏菌和大腸桿菌的可視化檢測；另一方面是基于過氧化物酶的酶促顯色反應來響應靶標物質識別，如由現有文獻公開了利用辣根過氧化物酶顯色，成功對鼠傷寒沙門氏菌和四環素類抗生素實現了高靈敏度檢測。然而，食品材料多樣性決定了食品含有各種干擾成分，容易影響金納米顆粒的分散聚集狀態或者誘使生物酶變性而失活，從而影響檢測結果的準確性和靈敏性。金納米簇是由幾個到幾十個金原子組成的類似分子的團簇結構。由于其量子尺寸效應，金納米簇失去傳統金納米顆粒的局部表面等離子體共振特性，而具有氧化酶和過氧化物酶催化活性。這種人工納米酶相比生物酶性質比較穩定，可以成為生物酶的替代品。同時金納米簇的催化活性很容易進行調節以滿足實際檢測的顯色需求。由于納米酶反應發生在納米材料表面，因此表面修飾是一種有效的調控酶活性的方法，其中包括表面涂層厚度、涂層官能團類型以及表面電荷等都會改變納米酶的催化能力。

致病菌的識別多以抗原與抗體間的免疫反應為基礎，雖在靈敏度上滿足了實際應用的要求，但存在選擇性差的問題，且大多數抗體的保存和處理需要特定的條件以防止其變性。核酸適配體(aptamer)是一類長度在25-90bp左右的單鏈DNA或RNA，能以高親和力和高選擇性結合靶標物，可以作為抗體的合適替代品。與抗體相比，核酸適配體具有合成簡單、價格低廉、穩定性高、對變性敏感性低、易于修飾多種功能基團等優點，因此利用核酸適配體可以有效解決實際研究應用中生物識別元件對食源性致病菌特異性識別的問題。