[發明專利]一種基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法

有效

• 申請號: 202110941392.1
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113899731B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 方舒婷;周漪波;阮奇珺;向章敏;黃啟紅
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心）
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 莫瑤江;蔣歡妹

1.一種基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)合成金納米簇；

(2)將核酸適配體通過氫鍵和靜電相互作用與金納米簇結合，得到核酸適配體與金納米簇的復合物；

(3)將核酸適配體與金納米簇的復合物置于H₂O₂/TMB顯色體系中；

(4)將待測樣品、核酸適配體與金納米簇依次混合孵育并加入H₂O₂/TMB顯色體系，通過測定加入待測樣品溶液的H₂O₂/TMB顯色體系與未加入待測樣品溶液的H₂O₂/TMB顯色體系之間的吸光度差值，建立標準曲線,定量測定樣品溶液中的副溶血性弧菌含量。

2.根據權利要求1所述的基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)包括：將一個20mL樣品瓶放置于磁力攪拌器上，設置磁力攪拌器的轉速為300～400rpm/min；取0.5mL超純水新鮮制備的HAuCl₄溶液和4.7mL濃度為60％的乙醇加入到樣品瓶中，充分混勻后，加入4mL谷胱甘肽溶液和0.6mLNaOH溶液，再次混合均勻，最后加入0.2mL NaBH₄溶液作為還原劑，并攪拌6～7h；攪拌結束后，將樣品瓶中的全部溶液注入透析袋中，并置于蒸餾水中透析24～28d后倒出，得到以谷胱甘肽為配體的金納米簇，最后1～4℃保存備用。

3.根據權利要求2所述的基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法，其特征在于，所述HAuCl₄溶液的濃度為20mM；所述谷胱甘肽溶液的濃度為5mM；所述NaOH溶液的濃度為0.2M；所述透析袋的截留分子量為3000Da。

4.根據權利要求1所述的基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)包括：將新鮮配制的核酸適配體溶液與步驟(1)合成的金納米簇充分混勻，之后以25～45℃的溫度孵育10～60min，形成核酸適配體與金納米簇的復合物，最后1～4℃冷藏備用。

5.根據權利要求1所述的基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，核酸適配體的濃度為0.5～15μM，核酸適配體溶液與金納米簇充分混勻之后以35℃的溫度孵育30min；所述步驟(3)中，H₂O₂/TMB顯色體系中，H₂O₂的濃度為50～300mM，TMB的濃度為5～30mM，體系的pH為3.8～5.0,反應溫度25～45℃，反應時間10～60min。

6.根據權利要求1所述的基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中，核酸適配體的濃度為5μM，金納米簇的濃度為4.8μM，待測樣品、核酸適配體與金納米簇依次混合后以35℃的溫度孵育30min；H₂O₂/TMB顯色體系中，H₂O₂的濃度為100mM，TMB的濃度為20mM，體系的pH為4.2，反應溫度35℃，反應時間2min。

7.根據權利要求1所述的基于核酸適配體對靶標菌和金納米簇親和力差異的副溶血性弧菌一步檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中，通過酶標儀記錄待測樣品溶液在652nm處的吸光度，對比未加入待測樣品溶液的H₂O₂/TMB顯色體系在652nm處的吸光度值，計算△A_652nm，繪制標準曲線，定量測定樣品溶液中的副溶血性弧菌含量。