[發明專利]基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：H7的方法

有效

• 申請號: 202110938671.2
• 申請日: 2021-08-16
• 公開（公告）號: CN113866408B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 蔣魯巖;王毅謙;朱振華;曾德新;高淵;楊天宇;封振;徐振東;張娜
• 申請（專利權）人: 南京海關動植物與食品檢測中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/58;C12N15/115;C01G49/08;B82Y30/00;B82Y40/00
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 王玉

本發明公開了一種基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：H7的方法，包括：取核酸適配體功能化的納米富集磁珠作為捕獲探針，捕獲反應體系中存在靶細菌，進行孵育后通過磁分離器回收磁珠適配體?靶細菌；然后向其中加入核酸適配體功能化的量子點；在磁場作用下富集磁珠，將沉淀重懸于緩沖液中使用熒光化學分析儀測定熒光強度，根據熒光強度確定食源性腸道致病菌O157：H7的菌落總數。本發明將功能化量子點應用于食品中E.coli?O157:H7檢測，結合核酸適配體功能化磁珠富集方法，最終建立E.coli?O157:H7高效快速檢測方法。

技術領域

本發明涉及一種基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：?H7的方法，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

大腸埃希氏菌(Escherichia?coli，E.coli)，也稱之為大腸桿菌，是人和動物腸道中最主要、?數量最多的細菌，屬于革蘭氏陰性菌。大腸桿菌的抗原成分復雜，可分為菌體抗原(O)、鞭毛?抗原(H)和表面抗原(K)，后者有抗機體吞噬和抗補體的能力。根據菌體抗原的不同，可將大?腸桿菌分為150多型，絕大多數的大腸桿菌是不具有致病性的，而少部分的大腸桿菌卻能夠?引起胃腸道、泌尿系統或中樞神經系統的疾病，稱為致病性大腸桿菌(enteropathogenic?Escherichia?coli，EPEC)。其中最具代表性的就是代號為O157:H7的大腸桿菌，它是EHEC(腸?出血性大腸桿菌)家族中的一員。O157:H7感染后的主要癥狀正是出血性腹瀉，嚴重者可伴發?溶血尿毒綜合征，危及生命。由于O157:H7危害較大，且可經食物和飲用水在人群中廣泛傳?播，O157:H7被列為常規檢測項目。

現在用于大腸埃希氏菌檢測的常規方法包括選擇性培養方法、以分子生物學為基礎的檢?測方法、免疫學檢測方法和近年來興起的生物傳感器檢測技術等。雖然這些方法是當前最基?礎和常見的檢測方法，但是各自存在不足之處，比如操作過程復雜、耗費時間較長、靈敏度和特異性不高、重復性較差等，因此建立高效快速檢測方法是有效預防大腸桿菌病、保障公?共衛生安全的必要基礎。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種基于核酸適配體、納米粒?子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：H7的方法，將功能化量子點應用于食品中?E.coli?O157:H7檢測，結合核酸適配體功能化磁珠富集方法，優化食品中E.coliO157:H7檢測?條件，最終建立E.coli?O157:H7高效快速檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明提供一種基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食?源性腸道致病菌O157：H7的方法，包括：

以E.coli?O157:H7為靶標，經過多輪篩選富集，獲得特異性結合E.coli?O157:H7的核酸?適配體；

對所構建的A5適配體進行生物素修飾，通過鏈酶親和素和生物素之間的結合反應，獲?得核酸適配體功能化的納米富集磁珠；

對所構建的A4適配體進行量子點修飾，通過共價修飾制備得到核酸適配體功能化的量?子點；

取核酸適配體功能化的納米富集磁珠作為捕獲探針，捕獲反應體系中存在靶細菌，進行?孵育后通過磁分離器回收磁珠適配體-靶細菌；然后向其中加入核酸適配體功能化的量子點，?進行孵育結合；在磁場作用下富集磁珠，將沉淀重懸于緩沖液中使用熒光化學分析儀測定熒光強度，根據熒光強度確定食源性腸道致病菌O157：H7的菌落總數。

進一步地，所述A5適配體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

進一步地，所述A4適配體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

進一步地，所述核酸適配體功能化的納米富集磁珠的制備方法為：

采用共沉淀法制備Fe₃O₄磁性納米粒子；