[發明專利]基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：H7的方法

有效

• 申請號: 202110938671.2
• 申請日: 2021-08-16
• 公開（公告）號: CN113866408B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 蔣魯巖;王毅謙;朱振華;曾德新;高淵;楊天宇;封振;徐振東;張娜
• 申請（專利權）人: 南京海關動植物與食品檢測中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/58;C12N15/115;C01G49/08;B82Y30/00;B82Y40/00
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 王玉

1.基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，包括：

以E.coli?O157:H7?為靶標，經過多輪篩選富集，獲得特異性結合E.coli?O157:H7的核酸適配體；

對所構建的A5適配體進行生物素修飾，通過鏈酶親和素和生物素之間的結合反應，獲得核酸適配體功能化的納米富集磁珠，所述A5適配體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；

對所構建的A4適配體進行量子點修飾，通過共價修飾制備得到核酸適配體功能化的量子點，所述A4適配體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

取核酸適配體功能化的納米富集磁珠作為捕獲探針，捕獲反應體系中存在靶細菌，進行孵育后通過磁分離器回收磁珠適配體-靶細菌；然后向其中加入核酸適配體功能化的量子點，進行孵育結合；在磁場作用下富集磁珠，將沉淀重懸于緩沖液中使用熒光化學分析儀測定熒光強度，根據熒光強度確定食源性腸道致病菌O157：H7的菌落總數。

2.根據權利要求1所述的基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述核酸適配體功能化的納米富集磁珠的制備方法為：

采用共沉淀法制備Fe₃O₄磁性納米粒子；

將Fe₃O₄磁性納米粒子分散于乙醇水溶液中，超聲混合，加入氨丙基三乙氧基硅烷，機械攪拌并充入氮氣保護，室溫反應7～10?h，然后用磁鐵進行磁分離，清洗、干燥后得到氨基功能化的Fe₃O₄磁性納米粒子；

基于戊二醛法制備親和素化氨基磁珠；

在A5核酸適配體的5’端進行生物素標記得到功能化的核酸適配體；

將親和素化氨基磁珠和功能化的核酸適配體混合，得到核酸適配體功能化的納米富集磁珠。

3.根據權利要求2所述的基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述共沉淀法制備Fe₃O₄磁性納米粒子的步驟如下：將濃度為0.12?mol/L?FeSO₄??7H₂O和濃度為0.2?mol/L?FeCl₃?6H₂O溶于去離子水溶液中，機械攪拌混合，并且通入氮氣，充分去除溶液中的溶解氧后，逐滴加入濃度為2.5?mol/L的氫氧化鈉溶液，使溶液pH達到11，在室溫下1000?rpm劇烈攪拌30?min，水解產生的Fe₃O₄磁性納米粒子以磁鐵分離，分別用蒸餾水、去離子水、無水乙醇依次清洗各五次，60?℃下真空干燥12h，得到Fe₃O₄磁性納米粒子。

4.根據權利要求2所述的基于核酸適配體、納米粒子和量子點標記檢測食源性腸道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述戊二醛法制備親和素化氨基磁珠的步驟如下：稱取5mg氨基化磁珠溶解于5mL?10mM磷酸鹽緩沖液中超聲20min；向體系中加入1.25mL?25%戊二醛，室溫緩慢振蕩1h，在磁鐵的作用下富集分離Fe₃O₄并用PBS清洗3次以去除物理性吸附的戊二醛；向Fe₃O₄磁性粒子加入500ul?1mg/mL的鏈霉親和素，室溫緩慢振蕩6?h；在磁鐵作用下富集分離親和素化氨基磁鐵，舍棄含有游離親和素的上清，用PBS反復清洗；向親和素化氨基磁珠中加入5?mL?10?mg/mL?的?BSA室溫緩慢振蕩?6?h?以封閉未反應的和非特異性結合位點，在磁鐵作用下富集分離磁性粒子并反復清洗，最終重懸于?5?mL?10?mM?的PBS?中，置于?4℃保存備用。