[發(fā)明專利]一種利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白與金屬離子配位固定化氧化還原酶的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110937217.5
• 申請(qǐng)日: 2021-08-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113564154A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王世珍;王琪琪;江亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N11/14
• 分類號(hào): C12N11/14;C12N11/02;C12N9/06;C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12R1/19
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;秦彥蘇

1.一種利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白與金屬離子配位固定化氧化還原酶的方法，其特征在于：在濃度為0.1～50mg/mL的羊毛角蛋白溶液中加入氧化還原酶，并使所述氧化還原酶的終濃度為0.1～100mg/mL，0～50℃混勻后，加入金屬離子并使其終濃度為0.8～40mM進(jìn)行配位，所述金屬離子包括Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺或Cu²⁺中的至少一種，隨后加入氧化石墨烯溶液并使其終濃度為0.01～100mg/mL，0～50℃混勻，即得氧化石墨烯-羊毛角蛋白與金屬離子配位復(fù)合材料固定化氧化還原酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧化還原酶包括氨基酸脫氫酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述氨基酸脫氫酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述羊毛角蛋白采用尿素/硫化鈉/十二烷基硫酸鈉工藝溶解羊毛制備得到；其中，羊毛、尿素、九水合硫化鈉與十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量比為4～20：22～50：5～20：1.4～2，溶解溫度為25～65℃，反應(yīng)時(shí)間2～20h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述羊毛角蛋白溶液的濃度為0.1～0.16mg/mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸脫氫酶通過(guò)重組表達(dá)方式制備得到，將可表達(dá)所述氨基酸脫氫酶的重組表達(dá)菌株接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后加入乳糖誘導(dǎo)劑IPTG；培養(yǎng)所得菌液，離心獲取細(xì)胞，配制成細(xì)胞懸液；超聲破碎并離心，收集上清液即為含有帶His-tag標(biāo)簽的氨基酸脫氫酶的粗酶液；采用鎳柱對(duì)得到的粗酶液進(jìn)行純化并除鹽，得到帶His-tag標(biāo)簽的氨基酸脫氫酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：可表達(dá)所述氨基酸脫氫酶的重組表達(dá)菌株的構(gòu)建方法為：用NdeI和Xhol分別雙酶切所述氨基酸脫氫酶基因和pET28a質(zhì)粒，連接轉(zhuǎn)化，得到pET28a-NTAaDH質(zhì)粒；將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，得到可表達(dá)帶His-tag標(biāo)簽的氨基酸脫氫酶的重組表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：將所述E.coli BL21(DE3)/pET28a以1～3％的接種量接種到所述含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的LB培養(yǎng)基包括：胰蛋白胨5.0～15.0g/L，酵母浸膏1.0～10.0g/L，NaCl 0.0～15.0g/L，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5，接種前添加卡那霉素使其終濃度為50～150μg/mL；培養(yǎng)條件為36～38℃，150～250rpm培養(yǎng)1.5～6h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為5～15mg/mL，繼續(xù)在25～30℃，150～250rpm下培養(yǎng)2～12h；培養(yǎng)所得菌液，離心獲得細(xì)胞，棄上清液，沉淀用pH 7～7.5的磷酸緩沖液重懸，充分洗滌后離心，重復(fù)操作若干次，用pH 6.5～8.0的磷酸緩沖液配制成濃度為50～150g/L的所述細(xì)胞懸液。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：還包括酶活力的檢測(cè)方法：氨基酸脫氫酶的活性測(cè)定反應(yīng)體系包含10μL，4mM NADH、160μL，pH 8～12濃度范圍為50～200mM的氯化銨-氨水作為氨基供體、10μL，40mM的底物溶液和20μL酶液，所述底物包括2-氧代-基丁酸乙酯、苯丙酮酸或α-酮戊二酸，340nm波長(zhǎng)下測(cè)定酶活；酶活力定義為在上述條件下，每分鐘氧化消耗或生成1μmol NADH所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

10.一種根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法所制備的氧化石墨烯-羊毛角蛋白與金屬離子配位復(fù)合材料固定化氧化還原酶。