[發明專利]一種利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白與金屬離子配位固定化氧化還原酶的方法

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• 申請號: 202110937217.5
• 申請日: 2021-08-16
• 公開（公告）號: CN113564154A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 王世珍;王琪琪;江亮
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/02;C12N9/06;C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12R1/19
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;秦彥蘇

本發明公開了一種利用氧化石墨烯?羊毛角蛋白與金屬離子配位固定化氧化還原酶的方法，屬于固定化酶技術領域。氧化石墨烯的結構穩定，生物相容性好，是一種優良的酶固定化載體。片層結構的氧化石墨烯有著高比表面積，高柔韌性和出色的可加工性，是一種優良的酶固定化載體。羊毛角蛋白由無規卷曲、α－螺旋和β－折疊平行多肽構象一起組成的極致密的結構，具有有效的功能化基團，與氧化石墨烯有很強的結合能力。本發明所得固定化氧化還原酶的pH穩定性和重復使用穩定性明顯增強，同時具有較高的酶活性回收率。本發明的優點在于工藝簡單、制備條件溫和、固定化率高。

技術領域

本發明涉及固定化氧化還原酶的方法，屬于酶固定化領域。

背景技術

氧化還原酶是一類能催化兩分子間發生氧化還原作用的酶的總稱，包括多種重要的酶類。其中，氨基酸脫氫酶(AaDH)可催化可逆的氨基酸氧化脫氨和酮酸還原胺化反應。對于非天然底物的還原胺化反應，選擇底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(EOPB)在含銨鹽體系中(提供NH₄⁺受體)進行還原胺化高選擇性生成L-高苯丙氨酸(LHPA)。利用AaDH可合成非天然氨基酸L-高苯丙氨酸(LHPA)，以便更廣泛地應用在藥物、新型生物材料和化妝品等領域。

由于游離的氨基酸脫氫酶穩定性差，采用固定化的方法可進行改善。固定化酶的性能取決于固定化酶所使用的載體材料的性質和固定化方法。酶的固定化材料包括無機、有機聚合物、凝膠以及生物材料等。目前的氨基酸脫氫酶等氧化還原酶的固定技術，還存在固定化酶穩定性差，重復利用活性低等問題。因此，還有必要對固定化載體和方法進行進一步研究。

發明內容

本發明提供了一種利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白與金屬離子配位固定化氧化還原酶的方法。氧化還原酶均可采用此方法，如氨基酸脫氫酶等。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案之一是：

一種利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白與金屬離子配位固定化氧化還原酶的方法，在濃度為0.1～50mg/mL的羊毛角蛋白溶液中加入氧化還原酶，并使所述氧化還原酶的終濃度為0.1～100mg/mL，0～50℃混勻后，加入金屬離子(Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺等)并使其終濃度為0.8～40mM進行配位，隨后加入氧化石墨烯溶液并使其終濃度為0.01～100mg/mL，0～50℃混勻，即得氧化石墨烯-羊毛角蛋白與金屬離子配位復合材料固定化氧化還原酶。

進一步地，所述氧化還原酶包括氨基酸脫氫酶。

優選地，所述氨基酸脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，帶有His-tag標簽。

進一步地，所述羊毛角蛋白采用尿素/硫化鈉/十二烷基硫酸鈉(SDS)工藝溶解羊毛制備得到；其中，羊毛、尿素、九水合硫化鈉與十二烷基硫酸鈉的質量比為4～20：22～50：5～20：1.4～2，溶解溫度為25～65℃，反應時間2～20h。

優選地，所述羊毛角蛋白溶液的濃度優選為0.1～0.16mg/mL，羊毛角蛋白溶液濃度為0.14～0.16mg/mL時固定化酶酶活最高。

氧化石墨烯(Graphene Oxide，GO)是石墨烯(Graphene)的一種重要的衍生物，具有良好的生物相容性，在生物醫藥、藥物緩釋、包裝材料等領域有廣闊的應用前景。GO具有和石墨烯相似的二維片層結構，通過控制化學氧化時間可以調控氧化程度。不同氧化程度的GO在碳骨架的二維平面上以及邊緣帶有不同數量的-OH、-COOH和-O-等含氧基團，具有不同的疏水性能，因此具有良好的生物相容性。