[發(fā)明專利]一種超微量全長(zhǎng)RNA測(cè)序文庫的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110936057.2
• 申請(qǐng)日: 2021-08-16
• 公開（公告）號(hào): CN113789364A
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛芹玉;施華娟;賈二騰;趙祥偉;劉芝余;白云飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發(fā)明公開超微量的全長(zhǎng)總RNA測(cè)序文庫的構(gòu)建方法，包括以下步驟：1）對(duì)獲得細(xì)胞或者亞細(xì)胞樣本中的超微量的總RNA，進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建，獲得包含rRNA序列信息的cDNA文庫；2）對(duì)獲得的cDNA文庫進(jìn)行無偏性擴(kuò)增；3）根據(jù)相應(yīng)物種的rRNA序列，設(shè)計(jì)sgRNA序列組合；4）將sgRNA序列組合配置的溶液與步驟擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA文庫進(jìn)行混合，獲得不包含rRNA信息的cDNA文庫。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)超微量的總RNA及全長(zhǎng)建庫，同時(shí)又能夠在cDNA合成之后使用CRISPR/Cas9高效切割PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的含有rRNA的cDNA文庫，從而避免RNA的降解；適用于超低起始量的轉(zhuǎn)錄組建庫，且花費(fèi)較低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種超微量全長(zhǎng)總RNA測(cè)序文庫構(gòu)建方法，尤其涉及一種基于模板轉(zhuǎn)換逆轉(zhuǎn)錄及CRISPR/Cas9高效切割去除rRNA，同時(shí)能夠通過編碼進(jìn)行細(xì)胞或者亞細(xì)胞樣本并行測(cè)序與分析的超微量的全長(zhǎng)總RNA轉(zhuǎn)錄組建庫方法。

背景技術(shù)

最近，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)(Single cell RNAsequencing,scRNA-seq)成為可能。2009年，Tang等人發(fā)表了第一個(gè)單細(xì)胞RNA-seq測(cè)序方案。但由于測(cè)序通量低，隨后STRT-seq和SCRB-seq作為新的方法被引入，它們可以同時(shí)處理多個(gè)不同的樣本，但通常會(huì)引入3′端或5′端的偏差，與之相比，Smart-seq2結(jié)合模板轉(zhuǎn)換方法，進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，可用于融合基因檢測(cè)、單核苷酸變異(SNV)分析、可變剪切等，成為了一種單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的理想方法。此外，為了減少上述方法中PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的偏差，CEL-seq和MARS-seq方法使用體外逆轉(zhuǎn)錄(IVT)替代PCR擴(kuò)增，獲得足夠多的cDNA量進(jìn)行測(cè)序，且降低了PCR擴(kuò)增偏差。最近，基于液滴和分裂池連接的方法能夠獲得數(shù)千個(gè)單細(xì)胞，為解析細(xì)胞異質(zhì)性和稀有細(xì)胞類型提供的新的可能。但所有的這些方法的不足都是通過oligo-dT的方法進(jìn)行mRNA及少量長(zhǎng)鏈非編碼RNA的富集，而其它的非編碼RNA很難獲取。這就限制了我們對(duì)非編碼RNA的深入解析，成為解析單個(gè)細(xì)胞中全部轉(zhuǎn)錄信息的主要障礙。

目前，研究者們?cè)谂﹂_發(fā)單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組RNA-seq方法，如最早的SUPeR-seq，利用特異性隨機(jī)引物富集非polyA的RNA，包括circRNAs。然而，SUPeR-seq對(duì)非polyA尾巴的RNA敏感性相對(duì)較低(20％-30％)。這為研究scRNA-seq測(cè)序非poly(A)尾RNAs的富集方法提供了空間。此外，一個(gè)不可忽視的問題就是在總RNA測(cè)序中，不感興趣的RNA物種豐度(如rRNA占細(xì)胞總量的80％-90％)會(huì)占據(jù)測(cè)序的容量，影響其它低豐度轉(zhuǎn)錄物的結(jié)果分析，同時(shí)還增加了測(cè)序的成本。目前，從總RNA中去除rRNA的方法包括兩種，直接富集多聚腺苷酸化(polyA)的轉(zhuǎn)錄本和靶向去除rRNA。前者主要由于rRNA無polyA尾，因此可以使用oligo(dT)引物富集含polyA尾的mRNA，也由于操作步驟簡(jiǎn)單方便而成為了大多數(shù)scRNA-seq富集mRNA的主要方法，包括Smart-seq2/3、CEL-Seq2等。然而，這種方法很容易產(chǎn)生偏差，因?yàn)樗コ顺齬RNA之外所有的非編碼轉(zhuǎn)錄本，如長(zhǎng)的非編碼RNA(lncRNA)、3′末端降解的mRNA等。另一種方法，rRNA特異性去除方法，通過使用生物素標(biāo)記的特異性探針(如Illumina’sRibo-Zero和Thermo Fisher’s RiboMinus)或RNase H介導(dǎo)的降解(如：NEB’s NEBNext)。雖然這些靶向去除的方法保留了大部分的非rRNA，但往往需要較高的樣本投入量10ng-1μg，遠(yuǎn)高于單細(xì)胞RNA量的要求，很難在scRNA-seq中應(yīng)用，從而限制了研究者對(duì)單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組信息的分析。