[發明專利]注射衣霉素誘導急性肝損傷小鼠模型的構建方法

在審

• 申請號: 202110933719.0
• 申請日: 2021-08-15
• 公開（公告）號: CN113647359A
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 楊蘭香;黃昭;郭豪杰;程旺開;熊冉;張佳佳
• 申請（專利權）人: 蕪湖職業技術學院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;A61D7/00
• 代理公司: 江蘇海越律師事務所 32402
• 代理人: 唐小紅

1.注射衣霉素誘導急性肝損傷小鼠模型的構建方法，其特征在于，需要以下步驟：

1)衣霉素溶液的配制；

1-1)150mM葡萄糖溶液的配制：精密稱取810.72mg葡萄糖溶于30ml滅菌水中，震蕩溶解；

1-2)0.1μg/μl衣霉素TM溶液的配制：精密稱取1mg衣霉素粉末溶解于100μl二甲亞砜(DMSO)中，再加入10ml的150mM葡萄糖溶液，震蕩溶解，4℃保存；

1-3)1％DMSO對照液的配制：取100μl二甲亞砜DMSO溶液加入到10ml的150mM葡萄糖溶液，震蕩溶解，4℃保存；

2)將7周齡C57BL/6小鼠按體重大小隨機分成對照組和實驗組兩組，每組數量按需要分配，實驗組開始腹腔注射步驟1-2)中配制的TM溶液100μl/10g，與此同時對照組腹腔注射步驟1-3)中配制的1％DMSO對照液100μl/10g，12h后處死取材；

3)觀察肝臟形態、病理圖并檢測肝損傷相關的生化指標。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中小鼠的體重為18g-20g，均為SPF級，飼養于SPF級動物房一周，飼養環境為溫度25℃、濕度為50％-55％、光照12h黑暗12h、自由進食和飲水，一周后按體重隨機分為對照組。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中腹腔注射時的步驟：吸取藥品，并去除氣泡；將針頭向上，吸取一段氣體后，在緩慢排除氣體，以達到取出氣泡的效果；用一只手抓住小鼠的尾巴向后拉，另一只手的大拇指和食指抓小鼠的頭背部皮毛，腹腔向上；將事先吸取好液體的注射器針尖平面朝上，平行扎入皮內后，注射器與腹腔呈45度角刺入腹腔，感覺針尖部分移動，注射樣品。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，對照組給藥具體如下：

每一只小鼠稱重并記錄體重，按照體重來給藥，每10g的重量腹腔注射100μl配制好的濃度為1％DMSO對照液，給藥12h后經摘除眼球收集血液后頸椎脫臼法處死小鼠，并收集小鼠肝臟。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟2)中實驗組給藥具體如下：

每一只小鼠稱重并記錄體重，按照體重來給藥，每10g的重量腹腔注射100μl配制好的濃度為0.1μg/μl的TM溶液，給藥12h后經摘除眼球收集血液后頸椎脫臼法處死小鼠，并收集小鼠肝臟。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，肝臟分析具體如下；

將收集好的小鼠肝臟用預冷的PBS緩沖液清洗后，放于培養皿上拍照記錄形態；

肝臟病理：首先取小鼠新鮮肝臟中間部位裝入包埋盒中并泡在4％PFA中過夜，過夜后采用乙醇梯度脫水法脫水，按下表1程序脫水；

表1

其次，將脫好水的組織取出，用石蠟包埋機包埋組織，再用石蠟切片機切厚度為4μm的組織；按下表2步驟進行蘇木素-伊紅HE染色；

表2

最后，染完色后，用中性樹膠封片，封片過程中要注意避免出現氣泡，吹干即可，在顯微鏡下觀察并拍照。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，血液生化指標檢測具體如下：

提前在滅菌的1.5ml EP中加入5μl的肝素鈉，使用前用手指彈管底，讓肝素鈉均勻分散在管壁上；小鼠取材前用摘眼球法取血，避免出現凝血現象；取完血后冰上靜置30min，在4℃條件下3000rpm離心15min，吸取上清液即為血漿，按照血漿谷丙轉氨酸ALT、谷草轉氨酸AST試劑盒說明書的方法步驟進行ALT、AST的檢測。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟3)中觀察肝臟形態具體如下：從肝臟形態上看，實驗組肝臟呈黃色，大而軟，部分區域呈黃白相間的斑紋狀；HE染色病理顯示實驗組肝索紊亂，胞質稀疏；生化指標表明，血漿AST、ALT顯著上升，此時腹腔注射衣霉素溶液從而誘導急性肝損傷的小鼠模型構建成功。