[發(fā)明專利]一種可以進入腫瘤細胞內(nèi)的RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白及其制備方法

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• 申請日: 2021-08-14
• 公開（公告）號: CN113603790A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊舉倫;馮強;黃晨晨;劉芳枘;潘鑫艷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/02;C07K1/22;C07K1/14;A61K39/395;A61K47/64;A61P35/00;C12R1/19
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本發(fā)明公開了一種可以進入腫瘤細胞內(nèi)的RGD?抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白的序列、表達和純化的制備方法及用途。本發(fā)明通過篩選不同的原核表達載體和菌株的組合，建立了最優(yōu)的融合蛋白原核重組表達系統(tǒng)，并優(yōu)化表達條件，使用發(fā)酵罐和AKTA層析系統(tǒng)建立了中試級別的表達及純化工藝。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，提高了融合蛋白的表達量和純度，為規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，同時該RGD?抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白能夠進入腫瘤細胞內(nèi)，與p21Ras蛋白結(jié)合，從而阻斷ras信號通路，達到抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的目的。該RGD?抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白在制備治療ras相關(guān)腫瘤制劑方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的涉及一種可以進入腫瘤細胞內(nèi)的RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白及其制備方法。

背景技術(shù)

ras基因是一種重要的細胞原癌基因，其命名來自大鼠肉瘤的英文rat asrcoma。ras基因家族包括三個主要成員：H-ras，K-ras及N-ras，其分別定位于第12，11以及1號染色體，編碼由188-189個氨基酸組成的分子量約為21KD的蛋白質(zhì)，三種Ras蛋白的氨基酸序列同源性為85％。

Ras蛋白作為極其重要的信號傳導(dǎo)傳遞蛋白調(diào)節(jié)細胞的正常分化及增殖。Ras蛋白在合成后，其羧基端必須經(jīng)過復(fù)雜的翻譯后修飾，使其準確的定位于細胞膜的內(nèi)側(cè)面才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。Ras蛋白在細胞外生長信號刺激下與GTP結(jié)合成為活性狀態(tài)的Ras-GTP形式，從而激活Ras蛋白下游眾多信號通道，促進細胞分裂，增生和惡性轉(zhuǎn)化。

當(dāng)ras基因發(fā)生突變或過表達時，與GTP結(jié)合成為活性狀態(tài)，導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化并促進惡性腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移。研究表明，大約30％的人類腫瘤中存在ras基因突變或ras基因的過表達。

利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的單鏈抗體是用柔性寡核苷酸片段連接完整抗體的可變區(qū)構(gòu)建的線性片段，分子量只有完整抗體的1/6，滲透力強，在非靶向組織中滯留時間短、易從體內(nèi)清除。而且由于沒有全抗體的Fc片段，免疫源性低，用于人體幾乎不會產(chǎn)生抗鼠抗體反應(yīng)。這種抗體通過與細胞內(nèi)特定蛋白的結(jié)合使其失活，阻斷其與其他蛋白的相互作用，或干擾該蛋白的正常胞內(nèi)定位，從而阻止其發(fā)揮正常生物學(xué)功能。

本發(fā)明利用小鼠抗體輕、重鏈混合引物，從經(jīng)過Ras蛋白免疫后的Balb/c小鼠脾B淋巴細胞中擴增獲得其輕、重鏈可變區(qū)基因片段。通過重疊延伸PCR技術(shù)，將柔性寡核苷酸和所述兩片段連接，構(gòu)建出抗p21Ras蛋白的單鏈抗體基因片段。為了制備可以特異進入腫瘤細胞的抗p21Ras單鏈抗體，本發(fā)明在前期基礎(chǔ)上將RGD穿膜肽和抗p21Ras單鏈抗體基因構(gòu)建為融合表達基因，并對RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合基因的密碼子進行優(yōu)化，將優(yōu)化后的RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白基因克隆至pET-32a原核表達載體，再將重組表達載體轉(zhuǎn)入Origami(DE3)大腸桿菌表達菌中，構(gòu)建出RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白重組表達系統(tǒng)。經(jīng)過一系列表達及純化條件的摸索，制備出能夠穿透腫瘤細胞膜、抑制腫瘤生長的RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述的不足，提供一種可以進入腫瘤細胞內(nèi)的RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

該RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白是由RGD穿膜肽、重鏈可變區(qū)、連接肽和輕鏈可變區(qū)組成的融合多肽；所述連接肽位于所述重鏈可變區(qū)與所述輕鏈可變區(qū)之間SEQ ID NO：2中第136-150位氨基酸序列。RGD穿膜肽序列位于SEQ ID NO：2中第1-11位氨基酸序列。

本發(fā)明的目的還在于提供了一種RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白重組表達質(zhì)粒，該重組表達質(zhì)粒由RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白基因克隆至原核表達質(zhì)粒pET-32a的Kpn I和Hind III酶切位點之間而成。所述RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白基因如SEQ IDNO：1所示。