[發明專利]一種可以進入腫瘤細胞內的RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 202110927679.9
• 申請日: 2021-08-14
• 公開（公告）號: CN113603790A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 楊舉倫;馮強;黃晨晨;劉芳枘;潘鑫艷
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/02;C07K1/22;C07K1/14;A61K39/395;A61K47/64;A61P35/00;C12R1/19
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1.一種編碼RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白的DNA分子或基因，其特征在于：編碼RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一種原核重組表達載體，其特征在于：含有權利要求1所述的DNA分子或基因片段，并將編碼RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白的基因片段克隆至原核表達載體pET-32a的Kpn I和Hind III限制性內切酶識別位點之間。

3.一種原核重組表達菌株，其特征在于：它由權利要求2所述的原核重組表達載體經過化學轉化或電轉化至大腸桿菌Origami(DE3)感受態中而成，并能夠表達RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白。

4.一種制備RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白的方法，其特征在于該方法包括如下步驟：a)將權利要求1所述RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白基因按照大腸桿菌宿主細胞的密碼子偏好進行密碼子優化后，克隆至原核表達載體pET-32a中，構建重組原核表達載體；b)將步驟a)所述重組原核表達載體轉化宿主細胞Origami(DE3)感受態中；c)通過自誘導培養基在發酵罐中誘導重組原核表達菌株表達RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白，發酵條件為：取pET32a-RGD-p21Ras scfv/Origami(DE3)二級種子液按1:20的比例接種于60L自誘導培養基中，以37℃、200rpm培養8h完成菌體擴增，再以20℃，pH7.4左右，200rpm的條件下誘導表達20h，期間通過流加乳糖、蛋白胨和酵母粉進行補料；d)離心收集菌體，使用超聲緩沖液重懸菌體，冰上超聲30min，在超聲裂解物加入純的TritonX-100至終濃度為1％(V/V)，冰上孵育10min，然后離心收集包涵體沉淀，并洗滌包涵體去除雜質，最后用平衡緩沖液溶解包涵體沉淀，離心收集上清液；e)利用AKTA層析系統采用鎳離子親和層析從上一步的包涵體溶解上清中分離純化RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白，純化條件為：用Xk30/20層析柱，其內徑為2cm，高為30cm，將25ml的Ni Sepharose 6FF/HP層析填料裝入柱中，設流速為10ml/min，用3個柱體積的平衡緩沖液平衡鎳柱后，將含有包涵體蛋白的平衡緩沖液向鎳柱上樣，保持壓力低于0.4MPa，上樣結束后用20倍柱體積的洗滌緩沖液(25mM咪唑/1XPBS)洗滌雜蛋白，當沖洗到流出液OD值小于0.01時，用5倍柱體積的洗脫緩沖液(250mM咪唑/1X PBS)洗脫目的蛋白并收集柱中的RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白，并通過梯度透析和復性使融合蛋白恢復免疫學活性。

5.RGD-抗p21Ras單鏈抗體融合蛋白在制備靶向殺傷腫瘤細胞藥物制劑中的應用，其特征在于：腫瘤細胞是胰腺癌細胞、肺癌細胞、腦膠質瘤細胞。