[發(fā)明專利]一種檢測Sf9細(xì)胞DNA含量的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110926897.0
• 申請日: 2021-08-12
• 公開（公告）號: CN114075594A
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李炯;魏霞蔚;魏于全;楊莉;王瑋
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明公開了Sf9細(xì)胞DNA的檢測方法，屬于DNA檢測領(lǐng)域。本發(fā)明以特定的引物序列(如SEQ ID NO.1～2所示)，可以有效檢測Sf9細(xì)胞DNA，具有良好的專屬性、較大的線性范圍、較高的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度，可應(yīng)用于Sf9細(xì)胞相關(guān)生物制品中Sf9細(xì)胞DNA殘留的檢測，應(yīng)用前景良好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于DNA檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

源于草地貪夜蛾蛹(Spodoptera frugiperda)卵巢組織的Sf9細(xì)胞對桿狀病毒高度敏感，被作為Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中最為常用的宿主細(xì)胞。因其生長快，大小均一、易于操作，適于轉(zhuǎn)染、生產(chǎn)高滴度病毒以及高效表達(dá)人源化重組蛋白，且抗機(jī)械剪切，能在無血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長等諸多優(yōu)勢，而被廣泛的用于基因蛋白工程產(chǎn)品的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)。

疫苗研究中，已有數(shù)十種病毒抗原蛋白在Sf9細(xì)胞中表達(dá)獲得，包括豬圓環(huán)病毒、禽流感病毒、偽狂犬病病毒、兔出血癥病毒等，其中豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)基因工程亞單位疫苗的商品化制備，已取得良好經(jīng)濟(jì)效益。

生物制品中宿主細(xì)胞DNA殘留是評判產(chǎn)品合格與否的關(guān)鍵性指標(biāo)，殘留的宿主細(xì)胞DNA作為制品中潛在致癌性和免疫原性雜質(zhì)，需嚴(yán)加控制和監(jiān)測，以確保制品的純度和安全性。由于外源DNA宿主DNA屬微量雜質(zhì)，測定時(shí)干擾因素多，如何對其進(jìn)行靈敏、快速、準(zhǔn)確的檢測是研究人員亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的問題是：提供一種可檢測Sf9細(xì)胞DNA的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于檢測Sf9細(xì)胞DNA殘留的PCR引物對，所述引物采用GenBank登錄號為MN385596.1的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物。

如前述的引物對，所述引物對序列如SEQ ID NO.1～2所示。

一種用于檢測Sf9細(xì)胞DNA殘留的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，包含前述引物對。

如前述的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系還包括Taq酶和DNA模板。

一種用于檢測Sf9細(xì)胞DNA殘留的方法，所述方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，包括使用前述的引物進(jìn)行序列擴(kuò)增的步驟。

如前述的方法，其特征在于：

所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR法使用前述的反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。

如前述的方法，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5s；95℃變性5s，60℃退火20s，72℃延伸10s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95℃10s，65℃ 60s，97℃ 1s。

如前述的方法，還包括：熒光定量PCR檢測已知濃度的Sf9細(xì)胞DNA標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待檢樣品中Sf9細(xì)胞DNA量。

如前述的方法，所述方法的檢測樣品為Sf9細(xì)胞參與生產(chǎn)的蛋白或代謝產(chǎn)物產(chǎn)品；

優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為蛋白藥物、重組疫苗或單克隆抗體。

一種用于檢測Sf9細(xì)胞DNA殘留的試劑盒，所述試劑盒包括Taq酶、引物對、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品；所述引物對為采用GeneBank登錄號為MN385596.1的核苷酸序列設(shè)計(jì)的特異性引物；所述陰性質(zhì)控品為無核酸酶水。

如前述的試劑盒，所述引物對為SEQ ID NO.1～2所示的PCR引物對。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1)專屬性好。對Sf9細(xì)胞基因組擴(kuò)增無雜峰，對人源細(xì)胞、小鼠源細(xì)胞和水均無擴(kuò)增。