[發明專利]原位雜交探針復合體、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 202110926702.2
• 申請日: 2021-08-12
• 公開（公告）號: CN113528513B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 王東;李賓;張濤;謝桂貞;沈邢
• 申請（專利權）人: 基因科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6841
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明提供了一種原位雜交探針復合體、其制備方法及應用。本發明揭示了一種優化的原位雜交探針復合體，由雜交探針1和雜交探針2組成；每個探針包括探針結合區、間臂連接區和互補配對區三個部分，并在5’和3’端進行可檢測標記物的標記。雜交探針1和雜交探針2通過互補配對區形成探針復合體，該復合體可以和兩組目標基因片段結合，并且攜帶4個可檢測標記物。本發明的技術方案既能夠顯著增加陽性樣品的染色強度，又可以有效降低原位雜交染色的背景信號，從而提高樣本檢測的準確性。

技術領域

本發明屬于基因檢測領域；更具體地，本發明涉及一種制備用于免疫組織化學檢測的原位雜交探針復合體、其制備方法及應用。

背景技術

原位雜交是采用特定標記的已知核酸序列為探針，與細胞或組織切片上的核酸序列發生雜交反應，對核酸進行精確定位的方法。因此可以借助于原位雜交，得到細胞中特定核酸的位置及豐度信息。該方法將與待測核酸分子序列互補的核酸探針溶解到雜交緩沖液中，并滴加到經蛋白酶消化的組織切片上，使核酸探針與目標核酸分子結合。在核酸探針上附加有檢測用的標記物(如熒光標記、地高辛標記等)，用適當的方法對標記物進行檢測，最后在顯微鏡下觀察結果。

對原位雜交探針進行熒光標記的操作相對復雜，熒光標記探針的穩定性差，容易發生降解，導致探針有效期較短，且需要使用相對昂貴的熒光顯微鏡來觀察結果。這些不利因素限制了熒光原位雜交探針在臨床上的推廣應用。

一般情況下，可以通過體外轉錄或化學合成的方式制備用于核酸原位雜交的探針。采用體外轉錄方式制備雜交探針時，可以將Dig-UTP混入轉錄體系，從而在探針上附加Dig標記。或者先合成寡核苷酸引物鏈，再通過化學修飾將Dig標記到引物上。采用Dig標記的原位雜交探針，其長度范圍多為30-200bp。對于雙螺旋的核酸分子，每1個堿基對的長度約為0.3-0.4nm，一個包含30個堿基的核酸探針與目標核酸結合后，總長度大約為10nm。而一個IgG抗體分子的直徑也在10nm左右。在原位雜交反應過程中，組織細胞被固定在玻璃片的表面，一個相對較短的雜交探針(比如30bp)與細胞中的目標核酸片段結合后，所攜帶的地高辛標記與抗地高辛抗體的結合會受到空間位阻的限制。所以，對于短片段的雜交探針，即使增加探針上Dig標記的數量，也不能捕獲到更多的抗地高辛抗體，不能增加陽性顯色的信號強度。如果使用較長的雜交探針(比如長100～200bp，且攜帶多個Dig標記)，單個雜交分子理論上可以捕獲多個抗地高辛抗體，從而增加顯色信號強度。但較長的雜交探針在溫和的雜交條件下(比如37～50℃溫育)，容易發生雜交探針的非特異性結合，導致顯色的背景信號加深，并影響染色結果的判斷。

鑒于此，本領域還需要進一步研究優化核酸原位雜交的探針試劑以及相應的檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于提供用于免疫組織化學檢測的原位雜交探針復合體及其制備方法。

在本發明的第一方面，提供一種制備原位雜交探針復合體的方法，包括：

(1)制備雜交探針1，其包括通過間臂連接區連接的探針結合區1和互補配對區1，在5’和3’端標記可檢測標記物；

(2)制備雜交探針2，其包括通過間臂連接區連接的探針結合區2和互補配對區2，在5’和3’端標記可檢測標記物；

其中，所述探針結合區1與所述探針結合區2分別與目標核酸的兩組區段互補；所述互補配對區1和互補配對區2互補形成探針復合體，從而一個復合體能結合兩組目標核酸區段、并由四組可檢測標記物進行信號報告。

在本發明的另一方面，提供一種原位雜交探針復合體，包括：

(1)雜交探針1，其包括通過間臂連接區連接的探針結合區1和互補配對區1，其5’和3’端標記有可檢測標記物；

(2)雜交探針2，其包括通過間臂連接區連接的探針結合區2和互補配對區2，其5’和3’端標記有可檢測標記物；