[發(fā)明專利]原位雜交探針復(fù)合體、其制備方法及應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110926702.2 | 申請日： | 2021-08-12 |
| 公開（公告）號： | CN113528513B | 公開（公告）日： | 2022-11-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王東;李賓;張濤;謝桂貞;沈邢 | 申請（專利權(quán)）人： | 基因科技（上海）股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/11 | 分類號： | C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6841 |
| 代理公司： | 上海專利商標事務(wù)所有限公司 31100 | 代理人： | 陳靜 |
| 地址： | 200241 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 原位雜交 探針 復(fù)合體 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種制備原位雜交探針復(fù)合體的方法，其特征在于，包括：
(1) 制備雜交探針1，其包括通過間臂連接區(qū)連接的探針結(jié)合區(qū)1和互補配對區(qū)1，在5’和3’端標記可檢測標記物；所述探針結(jié)合區(qū)1或所述互補配對區(qū)1的長度為20-40bp；
(2) 制備雜交探針2，其包括通過間臂連接區(qū)連接的探針結(jié)合區(qū)2和互補配對區(qū)2，在5’和3’端標記可檢測標記物；所述探針結(jié)合區(qū)2或所述互補配對區(qū)2的長度為20-40bp；
其中，所述探針結(jié)合區(qū)1與所述探針結(jié)合區(qū)2分別與目標核酸的兩組區(qū)段互補；所述互補配對區(qū)1和互補配對區(qū)2互補形成探針復(fù)合體，從而一個復(fù)合體能結(jié)合兩組目標核酸區(qū)段、并由四組可檢測標記物進行信號報告；所述雜交探針1和雜交探針2通過復(fù)性形成所述探針復(fù)合體；
所述間臂連接區(qū)將雜交探針分隔成兩個相對獨立的配對區(qū)域，所述間臂連接區(qū)不攜帶核苷酸堿基，不發(fā)生互補配對。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將雜交探針1和雜交探針2混合于含Tris-HCl，KCl，MgCl2的復(fù)性緩沖液中，形成雜交探針復(fù)合體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述復(fù)性緩沖液包括：10±2 mmol/L Tris-HCl pH8.5，50±5 mM KCl，1.5±0.3 mM MgCl2。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，雜交探針1和雜交探針2混合后，經(jīng)過80±5℃孵育10±2分鐘，50±3℃孵育20分鐘，形成雜交探針復(fù)合體。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可檢測標記物包括：地高辛，生物素、熒光素。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標核酸的兩組區(qū)段是序列相同的區(qū)段或序列不同的區(qū)段。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針結(jié)合區(qū)1或所述探針結(jié)合區(qū)2的長度為25-35bp，堿基序列與所要檢測的目標核酸序列互補；和/或
所述互補配對區(qū)1或互補配對區(qū)2的長度為25-35bp；所述互補配對區(qū)1或互補配對區(qū)2的堿基序列反向互補。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過1個或多個四氫呋喃形成間臂連接區(qū)，或者通過至少3個CH2形成間臂連接區(qū)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標核酸為EB病毒編碼的小RNA-1和EB病毒編碼的小RNA-2，所述雜交探針1的核苷酸序列如：SEQ ID NO:3-間臂連接區(qū)-SEQ IDNO:5所示；所述雜交探針2的核苷酸序列如：SEQ ID NO:4-間臂連接區(qū)-SEQ ID NO:6所示。
10.一種原位雜交探針復(fù)合體，其特征在于，包括：
(1) 雜交探針1，其包括通過間臂連接區(qū)連接的探針結(jié)合區(qū)1和互補配對區(qū)1，其5’和3’端標記有可檢測標記物；所述探針結(jié)合區(qū)1或所述互補配對區(qū)1的長度為20-40bp；
(2) 雜交探針2，其包括通過間臂連接區(qū)連接的探針結(jié)合區(qū)2和互補配對區(qū)2，其5’和3’端標記有可檢測標記物；所述探針結(jié)合區(qū)2或互補配對區(qū)2的長度為20-40bp；
其中，所述探針結(jié)合區(qū)1與所述探針結(jié)合區(qū)2分別與目標核酸的兩組區(qū)段互補；所述互補配對區(qū)1和互補配對區(qū)2互補形成探針復(fù)合體，從而一個復(fù)合體能結(jié)合兩組目標核酸區(qū)段、并由四組可檢測標記物進行信號報告；
所述間臂連接區(qū)將雜交探針分隔成兩個相對獨立的配對區(qū)域，所述間臂連接區(qū)不攜帶核苷酸堿基，不發(fā)生互補配對。
11.如權(quán)利要求10所述的復(fù)合體，其特征在于，所述的可檢測標記物包括：地高辛，生物素、熒光素。
12.如權(quán)利要求10所述的復(fù)合體，其特征在于，所述的目標核酸的兩組區(qū)段是序列相同的區(qū)段或序列不同的區(qū)段。
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