[發明專利]一種用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110920640.4
• 申請日: 2021-08-11
• 公開（公告）號: CN113667715A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 蔣析文;梁志坤;馬偉原;吳軼蘭
• 申請（專利權）人: 廣州達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 深圳市世聯合知識產權代理有限公司 44385
• 代理人: 姜妍

本申請屬于生物技術領域，涉及一種用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法及試劑盒，包括通過一步反應對DNA樣本以及與所述DNA樣本相對應的內標進行片段化處理，以實現對所述DNA樣本及所述內標進行末端修復、磷酸化及加A，獲得第一產物；將所述第一產物依次進行接頭連接和第一次純化處理，獲得第二產物；對所述第二產物依次進行PCR富集和第二次純化處理，獲得用于檢測下呼吸道樣本中病原體DNA文庫。本申請的DNA文庫構建過程簡便快捷，能夠適用于較低起始量及較差質量的DNA建庫；并添加有內標，以便后續生信分析結果的解讀。

技術領域

本申請涉及生物技術領域，尤其涉及用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法及試劑盒。

背景技術

中國醫院各科室發生醫院感染的比例存在明顯差異，有研究指出，醫院感染的易感染科室依次為外科ICU、血液科、急診科、呼吸內科和神經內科。而感染患者的年齡呈V形分布，主要是小于兩周歲的嬰幼兒及60歲以上的老年患者。嬰幼兒免疫系統尚未發育成熟，老年患者病情危重、免疫功能相對低下、侵入性操作較多、多伴基礎疾病，因而這兩個人群是目前醫院感染的高危人群。

隨著測序技術的發展，二代測序已經普遍成為一種臨床輔助診斷的技術手段，如以往的全外顯子，腫瘤，遺傳病測序等技術手段，近年來，宏基因組測序已成為熱點，市場上鮮少有針對宏基因組二代測序有效的建庫試劑盒。市場上缺少適用于人痰液、支氣管肺泡灌洗液等樣本的文庫構建的試劑盒。

對于建庫步驟而言，市場上還有一大半的建庫試劑流程是把片段化和末端修復分開做的，主要包括以下幾個步驟：1、對DNA進行超聲波片段化；2、對片段化產物進行磁珠純化；3、對片段化純化產物進行末端修復和加A；4、對加A產物進行接頭連接；5、對連接產物進行磁珠純化；6、對接頭連接純化產物進行富集；7、對富集產物進行磁珠分選或回收。以上步驟中包括三步純化，建庫步驟耗時比較長，多次磁珠純化會不可避免地增加DNA樣本的損耗，所以對DNA的總量和質量要求高。

目前市場上已有的片段化、末端修復和加A一步反應的試劑盒，都有不同程度的將模板量放大，不能真實反應樣本中的核酸組成情況。

肺泡灌洗液、痰液等下呼吸道樣本的宿主比例差異大，且存在大量的定植菌，現有試劑缺少內部標準品對結果進行歸一化矯正，會影響后期數據分析的準確性。

由此可見，現有的建庫步驟繁瑣，在多次磁珠純化上耗時長，對DNA的總量和質量要求高，片段化、末端修復和加A步驟無法一體化，或者可以一體化完成的又存在一定程度的模板量放大的情況。

發明內容

本申請實施例的目的在于提出一種文庫構建的方法，DNA文庫構建過程簡便快捷，適用于較低起始量及較差質量的DNA建庫過程。

為了解決上述技術問題，本申請實施例提供一種文庫構建的方法，采用了如下所述的技術方案：

一種用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，包括下述步驟：

通過一步反應對DNA樣本以及與所述DNA樣本相對應的內標進行片段化處理，以實現對所述DNA樣本及所述內標進行末端修復、磷酸化及加A，獲得第一產物；

將所述第一產物依次進行接頭連接及第一次純化處理，獲得第二產物；

對所述第二產物依次進行PCR富集及第二次純化處理，獲得用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫。

進一步的，所述片段化處理包括：將所述DNA樣本、所述內標、反應液B及酶混合液C置于PCR管中，

其中，所述反應液B包含:

Tris-HCL的終濃度為250mM，PH值為7.5；

MgCl₂的終濃度為50mM；

NaCl的終濃度為250mM；