[發明專利]一種用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110920640.4
• 申請日: 2021-08-11
• 公開（公告）號: CN113667715A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 蔣析文;梁志坤;馬偉原;吳軼蘭
• 申請（專利權）人: 廣州達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 深圳市世聯合知識產權代理有限公司 44385
• 代理人: 姜妍

1.一種用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，其特征在于，包括下述步驟：

通過一步反應對DNA樣本以及與所述DNA樣本相對應的內標進行片段化處理，以實現對所述DNA樣本及所述內標進行末端修復、磷酸化及加A，獲得第一產物；

將所述第一產物依次進行接頭連接及第一次純化處理，獲得第二產物；

對所述第二產物依次進行PCR富集及第二次純化處理，獲得用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫。

2.根據權利要求1所述的用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，其特征在于，所述片段化處理包括：將所述DNA樣本、所述內標、反應液B及酶混合液C置于PCR管中，

其中，所述反應液B包含:

Tris-HCL的終濃度為250mM，PH值為7.5；

MgCl₂的終濃度為50mM；

NaCl的終濃度為250mM；

DTT的終濃度為50mM；

Triton X-100的終濃度為0.75％；

ATP的終濃度為2.5mM；

dATP的終濃度為2.5mM；

dGTP的終濃度為2.5mM；

dCTP的終濃度為2.5mM；

dTTP的終濃度為2.5mM；

所述酶混合液C為Vvn endonuclease mutan、T7 endonuclease mutant和Taq DNApolymerase的混合溶液。

3.根據權利要求2所述的用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，其特征在于，所述片段化處理的反應條件為：

首先，在37℃下反應10～30分鐘后；隨后，在65℃下反應20～30分鐘。

4.根據權利要求1所述的用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，其特征在于，所述DNA片段化處理時，包括：

在插入的DNA片段大小為100bp時；首先，37℃下反應25～30分鐘后；隨后，在65℃下反應20～30分鐘；

在插入的DNA片段大小為150bp時；首先，37℃下反應15～25分鐘后；隨后，在65℃下反應20～30分鐘；

在插入的的DNA片段大小為200～700bp時；首先，37℃下反應10～15分鐘后；隨后，在65℃下反應20～30分鐘。

5.根據權利要求1所述的用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，其特征在于，所述通過一步反應對DNA樣本以及與所述DNA樣本相對應的內標進行片段化處理，以實現對所述DNA樣本及所述內標進行末端修復、磷酸化及加A，獲得第一產物的步驟包括：

所述內標加入的質量為對應的所述DNA樣本的

6.根據權利要求1所述的用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，其特征在于，所述將所述第一產物進行接頭連接步驟包括：

將所述第一產物、反應液D、反應液E和酶F加入PCR管中進行DNA片段連接反應，獲得DNA片段連接樣本；

其中，

所述反應液D包含:

Tris-HCL的終濃度為75mM，PH值為7.5；

MgCl₂的終濃度為15mM；

DTT的終濃度為15mM；

ATP的終濃度為2.75mM；

PEG8000的終濃度為20％；

所述反應液E包含濃度為2uM的接頭；

酶F為連接酶。

7.根據權利要求6所述的用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，其特征在于，所述將所述第一產物進行接頭連接的反應條件為：

在20℃下反應30分鐘。

8.根據權利要求6所述的用于檢測呼吸道樣本中病原體DNA文庫的構建方法，其特征在于，所述第一次純化處理包括：

將磁珠分裝至低吸附PCR管中；

將所述DNA片段連接樣本加入PCR管中，通過DNA磁珠純化，獲得第二產物。