[發明專利]生產漢黃芩素類化合物的基因工程酵母菌、其構建方法及應用

在審

• 申請號: 202110918657.6
• 申請日: 2020-04-07
• 公開（公告）號: CN113621530A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 蔡孟浩;錢芷蘭;陳鑫潔;趙清
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;上海辰山植物園
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/29;C12N15/31;C12N15/81;C12P17/06;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及生產漢黃芩素類化合物的基因工程酵母菌、其構建方法及應用。通過基因重組技術在酵母工程菌中引入了外源基因，獲得可生產漢黃芩素的酵母工程菌，其以白楊素作為前體生產漢黃芩素類化合物。所述酵母工程菌具有代謝背景低、異源表達能力強，可全細胞合成終產物以及終產物易分離等特征，為工業化生產黃酮類藥物提供了新思路。

本申請是申請號為202010263807.X、申請日為2020年4月7日的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及生產漢黃芩素類化合物的基因工程酵母菌、其構建方法及應用。

背景技術

黃酮類化合物廣泛存在于高等植物及蕨類植物中，屬于植物的次生代謝產物，是很多傳統中草藥植物的重要的活性成分。黃酮類化合物由于其結構的特殊性及多樣性因而具有多種多樣的生物學功能：治療心腦血管系統疾病，降血脂、降膽固醇、抑制血栓和擴張冠狀動脈的作用；提高甲狀腺對雌激素的敏感性，使甲狀腺C細胞分泌降鈣素的作用加強，最終抑制骨再吸收而治療骨質疏松癥；清除代謝過程中過量的自由基，保護肝細胞免受自由基親電子化合物和毒物的損害；抑制自由基的生成、降低脂質過氧化和刺激抗氧化酶的作用等。

黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是唇形科黃芩屬多年生草本植物，中國人以黃芩根部入藥已有兩千多年的歷史，其中藥理活性最為顯著的主要是根部特有的黃芩素類黃酮分子。此類根部特異性黃酮在結構上有別于其他黃酮，主要表現為B環上4’-OH的缺失。除了較為傳統的抗炎、抗病毒、抗氧化作用等，在癌癥、帕金森癥、阿茲海默癥等嚴重病癥的治療中黃芩素類黃酮分子也能起到積極作用。如黃芩素可通過下調抗凋亡的Mcl-1蛋白來誘導胰腺癌細胞凋亡以達到抗癌效果，同時還能抑制α-核蛋白的纖維形成以對抗帕金森癥；黃芩苷能保護神經元細胞免受淀粉樣β蛋白誘導的氧化應激以輔助預防阿茲海默癥，有選擇性地通過調節信號分子以阻滯人肺癌細胞的增殖；漢黃芩素可調控惡性腫瘤與正常淋巴細胞的氧化還原狀態以達到區別腫瘤細胞的效果等。目前，多種上市藥物中含有黃芩素、黃芩苷成分，如黃芩素鋁膠囊、黃芩苷膠囊、熊膽黃芩滴眼液等。

黃酮類化合物最常見的制備方法為直接通過物理或化學手段從植物中提取。植物提取法較為直接且操作簡單，但對植物原材料及有機試劑的大量消耗會使該法不僅深受氣候及地域因素限制，同時對人體和環境也造成損害。化學合成法涉及的反應劇烈，存在安全隱患，應用前景有限。目前生物法從頭合成黃芩素等黃芩根部特異性黃酮的案例較少，且明顯受到異源表達植物酶活較低的限制，黃酮產量低，提升空間有限，無法實現進一步的產業化應用。

原核生物大腸桿菌已被應用于異源合成一些化合物，但是本發明人針對黃芩素類化合物的研究中發現，植物酶與大腸桿菌的適配性較低，大腸桿菌中一些植物酶的表達不理想，難以運用黃芩這一物種來源的一些合成酶類在大腸桿菌中進行黃芩素類化合物的生產。一些反應所需的酶在大腸桿菌中表達時常無活性或低活性，需要大量的表達優化設計如增加融合標簽促進正確折疊等，但即便如此，也常常效果欠佳。例如，黃芩素類化合物生產中會引入細胞色素P450家族的酶，其在大腸桿菌難以表達或者必需經復雜改造才可能發揮部分活性。利用大腸桿菌工程菌株合成黃芩素的過程中，需人工添加L-苯丙氨酸前體才能合成，且合成效率低。此外，大腸桿菌的內毒素潛在地會導致藥物純化工藝的難度和要求更高。

現有技術中，酵母細胞表達化合物方面，盡管也有一些探索，但是本領域此前尚未成功運用酵母細胞來合成黃芩素類化合物，尤其是畢赤酵母細胞。這可能在于表達此類化合物需要引入較多基因，部分基因編碼的蛋白本身的催化活性不高，需要高表達才能滿足合成能力需求，而外源基因劑量過高導致酵母細胞的一系列生理問題。例如，外源基因過多而存在不穩定問題；蛋白折疊脅迫對于生理造成不利影響；蛋白質過量表達會消耗宿主細胞的碳源和能源，會給宿主帶來一定的代謝負擔。，盡管畢赤酵母已經被應用于較多種外源基因的表達，但是運用其進行多種外源基因的穩定共表達、并且實現高效生產在本領域中仍然存在瓶頸。