[發明專利]pSFV-p32病毒樣顆粒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110916396.4
• 申請日: 2021-08-11
• 公開（公告）號: CN113604505A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 方倪冉;黃梅;鄭航輝;徐婷;楊小云;董楠
• 申請（專利權）人: 華農（肇慶）生物產業技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/34;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 胡楓;李素蘭

本發明公開了一種pSFV?p32病毒樣顆粒的制備方法，包括：(1)構建得到pSFV?sp6?p32質粒；(2)將pSFV?sp6?p32、SFV?helper質粒體外轉錄成mRNA，然后將pSFV?sp6?p32、SFV?helper質粒體外轉錄的mRNA共電轉入BHK細胞中，得到pSFV?p32病毒樣顆粒。相應的，本發明還提供上述制得的pSFV?p32病毒樣顆粒及其應用。實施本發明，通過插入非洲豬瘟p32基因，制得的pSFV?p32病毒樣顆粒能夠高效表達外源蛋白p32，有利于非洲豬瘟蛋白的表達篩選和RNA疫苗研制。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種pSFV-p32病毒樣顆粒及其制備方法和應用。

背景技術

ASFV是一種大型的胞內復制病毒，易感細胞為豬單核-巨噬細胞系，破壞免疫系統引起豬的一種急性、熱性、高接觸性傳染病，即非洲豬瘟。非洲豬瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)在病毒分類中屬于DNA病毒目(dsDNA)、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)，是非洲豬瘟病毒科唯一的成員，病毒粒子呈二十面體對稱，平均直徑約為200nm。非洲豬瘟臨床癥狀以高熱、食欲廢絕、皮膚和內臟器官出血、高死亡率為主要特征，目前尚無有效的疫苗用于預防，一經發現只能大規模撲殺，對養豬業造成巨大損失。該病屬于世界動物衛生組織(OIE)要求法定報告的動物疫病，我國動物病原微生物名錄中將其列為一類動物疫病。病毒粒子結構由內到外分別為核質體、核衣殼、囊膜(分為外層與內層)：核質體主要由病毒基因組、DNA結合蛋白(p10、p14、p37、p34 等)及基因早期轉錄所需的酶組成；核衣殼主要含有結構蛋白p72和p17，由大約 2000個殼粒組成；內側囊膜來源于宿主的內質網，結合著p12、p22、p32、p54 及CD2v蛋白，外層囊膜為病毒出芽附帶產物，松散環繞在四周。ASFV基因組為線性雙鏈DNA分子，不同毒株全長大小不一，大致范圍在170～193kb，編碼 150-175個蛋白?；蚪M由中央保守區(約125kb)、兩側可變區(分別為38～48kb、 13～22kb)及基因組末端的反向重復序列(約2.1～2.5kb)組成。本文所研究的p32 蛋白分子量約為30kD。在病毒感染早期表達，能夠引起機體產生免疫反應，因此該蛋白具有比較好的抗原性。研究表明，針對p32蛋白的抗體能夠抑制病毒內化，說明p32蛋白也參與病毒進入細胞的過程。2018年8月之前我國尚未見非洲豬瘟發病的報道。但政府和研究人員從來沒有放松對此病的監控。我國在 2013年就加入全球非洲豬瘟聯盟，與世界各國成員共同加強非洲豬瘟的防控工作，開展對ASFV的基礎性研究。深入了解機體感染病毒后的免疫反應對ASF的預防和控制及疫苗研發具有非常重要的意義。近20年來，ASF亞單位疫苗和重組疫苗得到了廣泛的研究，多種參與ASFV感染機體的病毒蛋白，如p72、p32、 p54等成為研究的靶蛋白，但是目前研制的亞單位疫苗和重組疫苗仍不能對機體產生足夠的保護力，只能在一定程度上降低病毒血癥水平，延緩臨床癥狀出現的時間。

而RNA復制子疫苗是一種基于RNA的復制子、能夠進行自主復制的新型疫苗。這種疫苗在胞質中表達,不會和基因組發生整合,具有良好的安全性。 RNA復制子疫苗能夠自主復制誘導全身免疫細胞免疫和黏膜免疫，具有高效性、應用范圍廣等優點而倍受關注。RNA復制子是衍生于RNA病毒基因組并能自主復制的RNA。最常用于開發復制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒 (Alphavirus),如辛德比斯病毒(Sindbis virus,SIN)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)以及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus, VEE)；除甲病毒外，還有黃病毒、小RNA病毒、副粘病毒、杯狀病毒等。表達抗原的RNA復制子可由3種方式遞送:(1)體外轉錄的裸RNA；(2)構建成質粒DNA由細胞RNA聚合酶Ⅱ體內轉錄成復制子RNA(基于DNA)；(3)將復制子RNA包裝入病毒樣顆粒。