[發(fā)明專利]pSFV-p32病毒樣顆粒及其制備方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110916396.4
• 申請日: 2021-08-11
• 公開（公告）號: CN113604505A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發(fā)明（設計）人: 方倪冉;黃梅;鄭航輝;徐婷;楊小云;董楠
• 申請（專利權）人: 華農（肇慶）生物產業(yè)技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/34;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 胡楓;李素蘭

1.一種pSFV-p32病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括：

(1)構建得到pSFV-sp6-p32質粒；

(2)將pSFV-sp6-p32、SFV-helper質粒體外轉錄成mRNA，然后將pSFV-sp6-p32、SFV-helper質粒體外轉錄的mRNA共電轉入BHK細胞中，得到pSFV-p32病毒樣顆粒；

其中，所述pSFV-sp6-p32質粒是通過采用塞姆利基森林病毒為載體，并合成如SEQ IDNO.1所示的ASFV p32基因，然后將所述ASFV p32基因插入所述載體而得。

2.如權利要求1所述的pSFV-p32病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟(1)包括：

(1.1)合成ASFV p32基因，所述ASFV p32基因的序列為SEQ ID NO.1；

(1.2)設計引物tongyong-F，SP6-p32-R并合成，所述引物tongyong-F的序列為SEQ IDNO.2，所述引物SP6-p32-R的序列為SEQ ID NO.3；

(1.3)用BamHI/SmaI酶切雙酶切質粒pSFV-sp6-EGFP；

(1.4)將基因合成所述ASFV p32基因片段和步驟(1.3)酶切的載體片段同源重組，得到重組產物；

(1.5)將所述重組產物加入到感受態(tài)細胞DH5α細胞，進行重組產物轉化；

(1.6)將轉化后的重組產物進行重組產物鑒定；

(1.7)將鑒定后的重組產物提取質粒；

(1.8)對所述質粒進行酶切鑒定及測序。

3.如權利要求2所述的pSFV-p32病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟(1.3)中，所述pSFV-sp6-EGFP由下述方法制得：

設計與合成引物，所述引物包括設計引物Cs-EGFP-F和Cs-EGFP-R，以及菌液鑒定引物EGFP-鑒定-F和EGFP-鑒定-R：

以EGFP-C1為模板，以Cs-EGFP-F，Cs-EGFP-R為引物擴增Cs-EGFP片段，然后經(jīng)過酶切、同源重組、重組產物轉化和鑒定、提取質粒、酶切鑒定及測序，構建得到復制子質粒pSFVCs-sp6-EGFP；

以pSFVCs-sp6-EGFP為模板，以EGFP-F，EGFP-R為引物擴增片段，然后經(jīng)過酶切、同源重組、重組產物轉化和鑒定、提取質粒、酶切鑒定及測序，構建得到復制子質粒pSFV-sp6-EGFP。

4.如權利要求2所述的pSFV-p32病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟(1.6)中，將轉化后的重組產物進行重組產物鑒定包括：

將轉化后的重組產物過夜培養(yǎng)并挑選菌落進行菌液鑒定；

所述菌液鑒定的PCR體系包括菌液、設計引物tongyong-F，設計引物SP6-p32-R。

5.如權利要求1所述的pSFV-p32病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟(2)包括：

(2.1)線性化pSFV-sp6-p32和SFV-helper；

(2.2)將線性化后的pSFV-sp6-p32和SFV-helper進行體外轉錄；

(2.3)將pSFV-sp6-p32及SFV-heleper體外轉錄的mRNA共電轉入BHK細胞中，得到pSFV-p32病毒樣顆粒。

6.如權利要求1或5所述的pSFV-p32病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述SFV-helper質粒是通過構建如SEQ ID NO.4所示的重組載體，并合成如SEQ ID NO.5所示的插入片段基因，然后將所述插入片段基因克隆入所述重組載體而得。