[發(fā)明專利]一種活性小分子肽及其制備方法、應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202110909486.0 | 申請(qǐng)日： | 2021-08-09 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN113480607B | 公開（公告）日： | 2022-12-27 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 劉智禹;蘇永昌;劉淑集;陳貝;喬琨;許旻;陳曉婷 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 福建省水產(chǎn)研究所（福建水產(chǎn)病害防治中心） |
| 主分類號(hào)： | C07K7/06 | 分類號(hào)： | C07K7/06;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/36;C12P21/06;A61K38/08;A61P9/12;A61P3/10 |
| 代理公司： | 廈門律嘉知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 35225 | 代理人： | 張輝;溫潔 |
| 地址： | 361000 *** | 國省代碼： | 福建;35 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 活性 分子 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種活性小分子肽，其特征在于，
所述活性小分子肽為五肽，氨基酸序列：TLFGL。
2.一種活性小分子肽制備方法，其特征在于，
包括以下步驟：
S0：固定化ACE凝膠親和吸附柱的制備；
S01：將ACE溶解于硼酸鹽緩沖液制得ACE螯合配體溶液；
S02：往溴化氰活化瓊脂糖凝膠4B中加入稀鹽酸進(jìn)行溶脹，過濾后用硼酸鹽緩沖液清洗、濾干，除去殘余HCl，得溴化氰活化瓊脂糖4B填料；
S03：將ACE螯合配體溶液與溴化氰活化瓊脂糖4B填料混合，攪拌均勻后螯合過夜，螯合后，用4-6倍溴化氰活化瓊脂糖4B填料體積的硼酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗和過濾，除去多余的ACE；
S04：將濾干后的溴化氰活化瓊脂糖4B填料與Tris-HCl緩沖液混勻，進(jìn)行輕柔振蕩后過濾；
S05：過濾后，采用醋酸鹽緩沖液和Tris-HCl緩沖液交替清洗過濾3-5次，得ACE固定化凝膠填料，將ACE固定化凝膠填料懸浮于硼酸鹽緩沖液，裝填入層析柱，即為固定化ACE凝膠親和吸附柱；
ACE的酶活力單位為4.5-5.5U/ml；
硼酸鹽緩沖液的pH為8.1-8.4，摩爾濃度為0.08-0.12M，除步驟S05的硼酸鹽緩沖液外，其余步驟的硼酸鹽緩沖液均含有0.45-0.55M的NaCl；
溴化氰活化瓊脂糖凝膠4B與稀鹽酸的質(zhì)量體積比為0.8-1.2g：5mL，稀鹽酸的摩爾濃度為0.9-1.1mM；
螯合過夜的溫度條件為0-4℃；
Tris-HCl緩沖液的pH為7.9-8.1，摩爾濃度為0.08-0.12M，除步驟S05的硼酸鹽緩沖液外，其余步驟的硼酸鹽緩沖液均含有0.45-0.55M的NaCl；
輕柔振蕩的振蕩溫度為23-27℃，振蕩時(shí)間為1.8-2.2h；
醋酸鹽緩沖液的pH為3.8-4.2，摩爾濃度為0.08-0.12M，含有0.45-0.55M的NaCl；
S1：肽組分的制備，取河鲀鮮魚皮，絞碎后加入水，勻漿形成魚皮漿料液，加入蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后進(jìn)行滅酶處理，冷卻后調(diào)節(jié)pH值至中性，得酶解液，對(duì)酶解液進(jìn)行微濾，然后進(jìn)行超濾處理，獲得分子量小于1kDa的肽組分；采用酶活力單位為5萬U/g的堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為堿性蛋白酶添加量為魚皮漿料液質(zhì)量的0.8-1.2％，pH值為7.8-8.2，酶解溫度為58-62℃，酶解時(shí)間為5.8-6.2h；
絞碎后加入的水為蒸餾水，河鲀鮮魚皮與蒸餾水的質(zhì)量體積比為0.9-1.1kg:10L；
采用轉(zhuǎn)速為11000-13000rpm/min的組織勻漿器進(jìn)行勻漿；
酶解后通過煮沸加熱9-11min進(jìn)行滅酶處理，采用HCl調(diào)節(jié)pH值至中性；
微濾采用Φ30mm×800mm的陶瓷膜元件，過濾精度為200nm，膜通量為600-1000L/M2H，超濾采用截留分子量為1kDa的聚醚砜超濾膜；
S2：肽組分的親和吸附和洗脫，將所述步驟S1獲得的分子量小于1kDa的肽組分用所述步驟S0制得的固定化ACE凝膠親和吸附柱進(jìn)行親和吸附和洗脫，并進(jìn)行紫外檢測，紫外檢測波長為220nm，收集洗脫峰組分，對(duì)洗脫峰組分進(jìn)行脫鹽，減壓濃縮后待用；
S21：在中壓蛋白純化儀上，安裝好所述步驟S0制得的固定化ACE凝膠親和吸附柱，用摩爾濃度為0.08-0.12M、pH為7.9-8.1的硼酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡18-22min，平衡流速0.45-0.55mL/min，并在紫外檢測儀檢測，紫外檢測波長為220nm；
S22：平衡后進(jìn)行所述步驟S1獲得的分子量小于1kDa的肽組分的上樣吸附，上樣量4.5-5.5mL，流動(dòng)相用摩爾濃度為0.08-0.12M、pH為7.9-8.1的硼酸鹽緩沖液，流速0.45-0.55mL/min，觀察至檢測基線平穩(wěn)后14-16min，以摩爾濃度為0.08-0.12M、pH為7.9-8.1的硼酸鹽緩沖液為洗脫流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，且硼酸鹽緩沖液含有0.8-1.2M的NaCl，洗脫流速0.45-0.55mL/min，收集洗脫峰組分；
S23:固定化ACE凝膠親和吸附柱用摩爾濃度為0.08-0.12M、pH為7.9-8.1的硼酸鹽緩沖液重新進(jìn)行平衡18-22min后，按步驟S22進(jìn)行多次的肽組分上樣和洗脫，將多次洗脫峰組分合并，采用截留分子量為100D的透析袋對(duì)洗脫峰組分進(jìn)行脫鹽，減壓濃縮后待用；
S3：肽的序列鑒定，對(duì)步驟S2減壓濃縮后的洗脫峰組分進(jìn)行質(zhì)譜測定，對(duì)質(zhì)譜測定的結(jié)果進(jìn)行分析，得到其中一條活性小分子肽的氨基酸序列為TLFGL；
采用LC-MS/MS進(jìn)行質(zhì)譜測定，測定條件為：色譜柱為PepMap RPLC C18,75μm i.d.×150mm,3μm，陽離子模式，掃描范圍：m/z 300-1500Da，發(fā)射極噴霧電壓2-kV，質(zhì)譜測定的結(jié)果用PEAKS STUDIO軟件進(jìn)行分析，獲得高可信活性小分子肽氨基酸序列；
S4：將活性小分子肽TLFGL按步驟S3測定的氨基酸序列進(jìn)行固相合成，驗(yàn)證合成活性小分子肽的ACE抑制活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性小分子肽在制備降血壓藥物或二肽基肽酶Ⅳ抑制劑中的應(yīng)用。
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