[發明專利]鑒別特早熟玉環柚‘早玉文旦’的多重SSR標記引物及方法

在審

• 申請號: 202110908764.0
• 申請日: 2021-08-09
• 公開（公告）號: CN114058724A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 沈建軍;李海波;陳友吾;宋其巖;葉碧歡;李元春
• 申請（專利權）人: 浙江省林業科學研究院;玉環市自然資源和規劃局
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一種鑒別特早熟玉環柚‘早玉文旦’品種的分子特征性多重熒光SSR標記引物組及方法。所述分子特征性多重熒光SSR引物如下：引物Cg_U213：上游引物Cg_U213F：5′?FAM?AAGAGAAAGGGAGACCGAGC?3′，下游引物Cg_U213R：5′?CTCTCCCTCTCACGTTCCAG?3′；引物CT02：上游引物CT02F：5′?HEX?ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG?3′，下游引物CT02R：5′?TGACTGTTGGATTTGGGATG?3′；本發明所述的分子特征性多重熒光SSR引物可利用幼葉DNA對特早熟玉環柚‘早玉文旦’進行快速的早期鑒別，同時也可對柚類品種葡萄柚、紅心柚、早香柚和玉環文旦進行鑒別，方法簡單、快捷、準確，是傳統方法即在掛果后根據果實形態學特征鑒別柚類品種所不能替代的高效分子手段。

(一)技術領域

本發明涉及一種快速鑒別特早熟玉環柚‘早玉文旦’優良品種的分子特征性多重熒光SSR標記引物及方法。

(二)背景技術

中國是柚類起源中心之一，栽培歷史悠久，種質資源豐富，形成了包括福建、浙江、中國臺灣的東南沿海柚產區，和以廣西及廣東為主的華南柚區和以四川、重慶、湖南、貴州為主的西南柚區。浙江省作為東南沿海柚區重要組成之一，舟山、麗水、臺州、溫州等地具有許多特征明顯的地方資源。

早熟玉環柚‘早玉文旦’是玉環縣近年來出現的一個優良栽培品種，相比普通玉環柚可以提早一個半月上市，含糖高、化渣好，酸甜適中、豐產性和適應性強，2015年普通玉環柚平均每斤1.9元，特早熟玉環柚每斤 8元；2016年普通玉環柚平均每斤4.5元，特早熟玉環柚每斤12元，且供不應求。農戶經營特早熟玉環柚獲得的經濟效益相比經營普通玉環柚更好。目前特早熟玉環柚和普通玉環柚間的種質差異需等到掛果后才可以鑒別，很大程度上影響了玉環柚苗木的繁育周期和品種間鑒定。

柚類種質和品種資源繁多，現有的鑒別方法包括從葉片或果實形態學和生物化學方法對柚類品種(系)的鑒定和識別過程較為困難和復雜，準確度不高，成本較高且耗時耗力。盡管高光譜成像技術可用于柚類品種的鑒別，但數據波段數眾多，數據量大，建模的計算工作量繁瑣，直接影響建模的速度，而且光譜間存在強相關性，冗余信息多，影響建模的精度和穩定性。因此這些方法并不真正適合于柚類品種的鑒別。

自2000年以來，基于PCR的分子標記技術如RAPD(隨機擴增多態性DNA)、SRAP(相關序列擴增多態性)和SSR(簡單重復序列；或 Microsatellite，微衛星)相繼用于了柚類品種的親緣關系和遺傳多樣性分析。SNP(單核昔酸多態性)基因分型技術也用于了柚類品種鑒定。RAPD 和SRAP分子標記所采用的均為通用引物，需經大工作量的多態性篩選，而且PCR擴增圖譜復雜、重復性較差，引物的特異性不高。利用SNP基因分型技術鑒定柚類品種存在的問題是SNP位點的獲得較難，且單個 SNP分子標記的多態信息含量較低。基于SNP的等位基因特異性PCR法 (AS-PCR)在操作過程中對反應條件比較敏感，易發生非特異性擴增導致假陽性，易產生大量引物二聚體導致PCR失敗；基于SNP的高分辨率熔解曲線法(HRMA)分析儀器昂貴，試劑成本較高。因此這些分子生物學技術也不是柚類品種鑒定的理想選擇。

熒光SSR標記的開發是基于DNA測序平臺的毛細管電泳檢測方法，是以不同顏色的熒光基團(如FAM、HEX、TAMRA等)來標記一對SSR 引物中的一個引物末端，利用熒光檢測器對產物檢測，達到自動識別擴增產物的大小，克服了傳統銀染法聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的不足，具有快速、高效、精確、靈敏等技術優勢。熒光多重SSR標記技術則進一步結合了多重PCR(Multiplex PCR)與熒光SSR標記二項技術的優點，可以在一個PCR反應體系中加入多對SSR引物組合，同時檢測出多個基因型，從而解決了在進行大批量、多批次檢測時的費時費力以及成本高的缺陷。因此，利用熒光多重SSR標記技術開發柚類新品種或優良、特色品種的特征SSR指紋(基因型組合)，揭示特早熟玉環柚與其他柚類品種間的基因型差異，對于‘早玉文旦’優良品種的鑒別與知識產權保護具有重要意義。

(三)發明內容