[發(fā)明專利]鑒別特早熟玉環(huán)柚‘早玉文旦’的多重SSR標(biāo)記引物及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110908764.0
• 申請(qǐng)日: 2021-08-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114058724A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈建軍;李海波;陳友吾;宋其巖;葉碧歡;李元春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院;玉環(huán)市自然資源和規(guī)劃局
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 浙江千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

1.鑒別特早熟玉環(huán)柚‘早玉文旦’品種的分子特征性多重?zé)晒釹SR標(biāo)記引物，其核苷酸序列如下：

引物Cg_U213：

上游引物Cg_U213F：5′-FAM-AAGAGAAAGGGAGACCGAGC-3′

下游引物Cg_U213R：5′-CTCTCCCTCTCACGTTCCAG-3′；

引物CT02：

上游引物CT02F：5′-HEX-ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG-3′

下游引物CT02R：5′-TGACTGTTGGATTTGGGATG-3′。

2.一種快速鑒別鑒別特早熟玉環(huán)柚‘早玉文旦’品種的方法，所述方法包括：提取待測(cè)柚類品種幼嫩葉片的基因組DNA作為模板，以分子特征性多重?zé)晒釹SR引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，若熒光毛細(xì)管電泳峰圖上出現(xiàn)的基因型為256/256和136/140，則待測(cè)柚類品種為特早熟玉環(huán)柚‘早玉文旦’；若出現(xiàn)的基因型為250/250和136/140、256/262和136/140、250/262和136/140以及256/256和136/136，則待測(cè)柚類品種分別為葡萄柚、紅心柚、早香柚和玉環(huán)文旦；

所述分子特征性多重?zé)晒釹SR引物如下：

引物Cg_U213：

上游引物Cg_U213F：5′-FAM-AAGAGAAAGGGAGACCGAGC-3′

下游引物Cg_U213R：5′-CTCTCCCTCTCACGTTCCAG-3′；

引物CT02：

上游引物CT02F：5′-HEX-ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG-3′

下游引物CT02R：5′-TGACTGTTGGATTTGGGATG-3′。

3.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，57.6℃退火15s，72℃延伸15s，共35個(gè)循環(huán)；最后于72℃補(bǔ)平2min，終止溫度為4℃。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法如下：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后于96℃變性5min，將變性后的稀釋產(chǎn)物在-20℃下迅速冷凍2min后置入ABI3730 XL Genetic Analyzer分析儀，與內(nèi)標(biāo)GeneScan^TM-500 LIZ Size Standard同步進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，用Data Collection 3.0軟件收集數(shù)據(jù)。

5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取待測(cè)柚類品種幼嫩針葉，加液氮磨碎，提取柚類的基因組DNA；

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特征性多重?zé)晒釹SR引物為擴(kuò)增引物，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增：

PCR反應(yīng)體系每25μL組成如下：

多重PCR反應(yīng)條件如下：

98℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，57.6℃退火15s，72℃延伸15s，共35個(gè)循環(huán)；最后于72℃補(bǔ)平2min，終止溫度為4℃；

(3)內(nèi)標(biāo)配制：取10ml Hi-Di和80μLGeneScan^TM-500 LIZ Size Standard混勻，離心，以每孔10μL分裝于96孔內(nèi)標(biāo)板，離心；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋，離心；取稀釋產(chǎn)物按0.5μL/孔加入到分配好的96孔內(nèi)標(biāo)板中，混勻，離心，置入PCR儀，于96℃變性5min，之后在-20℃下迅速冷凍2min，離心，得到變性后的PCR產(chǎn)物將變性后的PCR產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)同步置入ABI 3730 XLGenetic Analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，用Data Collection 3.0軟件收集數(shù)據(jù)；

(4)數(shù)據(jù)分析：用GeneMapper 4.1軟件對(duì)Data Collection 3.0軟件收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，軟件系統(tǒng)將根據(jù)目標(biāo)峰的位置與同一泳道中的內(nèi)標(biāo)GeneScan^TM-500 LIZ SizeStandard進(jìn)行比較，直接讀出目標(biāo)SSR片段的準(zhǔn)確峰值，等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/X；

(5)結(jié)果判斷：若熒光毛細(xì)管電泳峰圖上出現(xiàn)的基因型為256/256和136/140，則待測(cè)柚類品種為特早熟玉環(huán)柚‘早玉文旦’；若出現(xiàn)的基因型為250/250和136/140、256/262和136/140、250/262和136/140以及256/256和136/136，則待測(cè)柚類品種分別為葡萄柚、紅心柚、早香柚和玉環(huán)文旦。