[發(fā)明專利]一種基于NtPIF1基因表達(dá)水平篩選硃砂煙植株的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110908424.8
• 申請(qǐng)日: 2021-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN113584210B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋中邦;隋學(xué)藝;張誼寒;王亞輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/29
• 代理公司: 成都市鼎宏恒業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 51248
• 代理人: 吳錦德

本發(fā)明涉及一種基于NtPIF1基因表達(dá)水平篩選硃砂煙植株的方法，所述的基因?yàn)镹tPIF1基因；序列為SEQ?ID?NO.1；所述的方法包括以下步驟：?jiǎn)沃陹炫凭幪?hào)、葉片取樣、RNA提取及cDNA合成、基因表達(dá)水平檢測(cè)、套袋自交收種。本發(fā)明首次公開利用NtPIF1基因表達(dá)水平篩選硃砂煙植株，且煙草葉片不需進(jìn)行任何處理直接取樣檢測(cè)，篩選出的植株烤后葉片呈現(xiàn)顯著硃砂特征。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于煙草遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及硃砂煙植株的篩選基因、序列及方法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

栽培煙草(Nicotiana?tabacum)是源于兩個(gè)祖先種絨毛狀煙草(N.tomentosiformis)和林煙草(N.sylvestris)通過(guò)種間雜交加倍而形成的異源四倍體，但其葉片主要生物堿與兩個(gè)祖先迥異。大部分栽培煙草的綠色和衰老葉片中，尼古丁是主要生物堿，約占生物堿總量的90～95％。絨毛狀煙草在綠色及衰老葉片中均積累去甲基尼古丁；而林煙草在綠色葉片中主要積累尼古丁，但在葉片衰老過(guò)程中大部分尼古丁轉(zhuǎn)化為去甲基尼古丁。白肋煙是普通煙草的一種類型，其“非轉(zhuǎn)化株”的主要生物堿為尼古丁，但每一世代群體中約有20％單株發(fā)生未知突變成為“轉(zhuǎn)化株”，“轉(zhuǎn)化株”中主要生物堿為去甲基尼古丁。烤煙單株也會(huì)發(fā)生類似突變，其煙葉主要累積去甲基尼古丁，且突變株烤后煙葉表面呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，國(guó)外學(xué)者稱為“Cherry-red”，我國(guó)稱之為“硃砂煙”。硃砂煙出現(xiàn)概率極低，有研究表明在538個(gè)單株中發(fā)現(xiàn)3株硃砂煙，概率約為0.56％。硃砂煙具有獨(dú)特的“糯米香”，是云南地區(qū)煙民抽吸水煙筒時(shí)深受歡迎的調(diào)香原料。采集硃砂煙資源煙葉和常規(guī)煙葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)NtPIF1基因在二者之間表達(dá)水平差異極其顯著，因此可以作為篩選硃砂煙植株的標(biāo)記基因。

硃砂煙葉作為特色原料，具有廣泛的應(yīng)用前景。但目前硃砂煙生產(chǎn)主要通過(guò)收購(gòu)環(huán)節(jié)人工挑選具有硃砂特征的田間突變煙葉，導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量不穩(wěn)定，煙葉質(zhì)量存在諸多缺陷。篩選出能夠穩(wěn)定遺傳的硃砂煙資源是硃砂煙規(guī)模化開發(fā)的前提基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

由于硃砂煙與常規(guī)烤煙在生長(zhǎng)階段難以通過(guò)外觀區(qū)分，無(wú)法篩選出硃砂煙植株并收種，造成無(wú)硃砂煙種子用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明正是為了解決上述問(wèn)題缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種硃砂煙植株的篩選基因、序列及方法。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

硃砂煙植株的篩選基因，本發(fā)明所述的基因?yàn)镹tPIF1基因；序列為SEQ?ID?NO.1。

基于本發(fā)明上述基因篩選硃砂煙植株的方法，所述的方法包括以下步驟：?jiǎn)沃陹炫凭幪?hào)、葉片取樣、RNA提取及cDNA合成、基因表達(dá)水平檢測(cè)、套袋自交收種。

本發(fā)明所述的步驟具體為：

步驟(1)單株掛牌編號(hào)：所有待篩煙草單株掛牌，并標(biāo)記唯一編號(hào)；

步驟(2)葉片取樣：取煙株幼嫩葉片組織0.1g左右置于液氮保存；

步驟(3)RNA提取及cDNA合成：提取葉片組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

步驟(4)基因表達(dá)水平檢測(cè)：根據(jù)NtPIF1基因序列設(shè)計(jì)特異qPCR引物，以葉片cDNA為模板進(jìn)行qPCR分析，NtPIF1基因表達(dá)水平達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)即為硃砂煙植株；

步驟(5)根據(jù)qPCR結(jié)果找到對(duì)應(yīng)編號(hào)植株，套袋自交收種，獲得穩(wěn)定的硃砂煙遺傳資源。

本發(fā)明所述的步驟(4)標(biāo)準(zhǔn)為：達(dá)到低于內(nèi)參基因Actin的1/100，即Target/Reference＜1*10^-2。

本發(fā)明所述的步驟(4)特異qPCR引物為NtPIF1qF1：CGGAGGTGGCAGCGGTGATGC、NtPIF1qR1：ACGTTCGAAGGAGGAGGAGTC；

NtACTIN基因作為內(nèi)參，為：