[發明專利]一種酶活提高及最適pH改變的NADH氧化酶突變體

有效

• 申請號: 202110908307.1
• 申請日: 2021-08-09
• 公開（公告）號: CN113667651B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 楊套偉;饒志明;武文慧;張顯;徐美娟;邵明龍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P7/26
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一種酶活提高及最適pH改變的NADH氧化酶突變體，屬于基因工程技術領域。本發明提供的NADH氧化酶突變體N20D、Y66D、N116E、N20D/Y66D、N20D/N116E均能夠實現在中性條件下酶活提高的技術效果，并且，NADH氧化酶突變體N20D/N116E的最適pH從9.0下調到了7.0，比酶活也得到顯著提升，在pH?7.0時比酶活可達9.19U/mg蛋白，是野生型的2.9倍，加強了該酶再生NADsupgt;+/supgt;的能力，為工業化氧化還原酶催化提供了一種實際有效的輔酶再生策略。

技術領域

本發明涉及一種酶活提高及最適pH改變的NADH氧化酶突變體，屬于基因工程技術領域。

背景技術

如今工業生物催化已成為生物技術領域中具有良好發展前景的新興研究方向之一。酶作為一種重要的催化劑，在工業催化中扮演著關鍵性的角色。據統計，只有15％已被發現與研究的酶被應用于工業，其中氧化還原酶作為占比最大的一類酶，在工業生物催化領域具有重要的應用價值。目前已知絕大部分的氧化還原酶在催化過程中需要輔酶(NAD(P)⁺/NAD(P)H)參與電子傳遞以促進底物的轉化。然而，輔酶價格較高、在溶液中不穩定、重復利用率極低，在催化反應體系中添加大量輔酶將極大增加反應成本，這也導致氧化還原酶的進一步工業應用被嚴重限制。因此，構建高效、環保和低成本的輔酶再生系統對工業生物催化的發展具有重要意義，也可以解決工業應用中輔酶成本高和利用率低等難題。

NADH氧化酶(NOX酶)廣泛存在于各種生物體內，可直接消耗溶解氧以催化氧化NADH生成NAD⁺，因此可應用于NAD⁺的再生研究。同時產H₂O型NADH氧化酶除了具有高效催化的特點，由于其催化產物是水，無副產物生成，環境友好和操作簡單，在工業中具有較大的應用潛力。但目前的NADH氧化酶的最適反應pH較高，多依賴強堿的反應環境，在中性條件下酶活較低，這一缺陷無疑會使其作為再生系統的使用范圍受限。

發明內容

為了解決現有技術中NADH氧化酶的最適反應pH較高，多依賴強堿的反應環境，在中性條件下酶活較低等技術問題，本發明提供了一種NADH氧化酶突變體，本發明的NADH氧化酶突變體在溫和條件下的酶活提高，能夠提高NAD⁺再生系統的反應效率，同時降低反應成本。

本發明的突變體是將氨基酸序列如SEQ?I?D?NO.1所示的NADH氧化酶的第20位的天冬酰胺突變為天冬氨酸得到的；命名為N20D；

或所述突變體是將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的NADH氧化酶的第66位的酪氨酸突變為天冬氨酸得到的；命名為Y66D；

或所述突變體是將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的NADH氧化酶的第116位的天冬酰胺突變為谷氨酸得到的；命名為N116E；

或所述突變體是將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的NADH氧化酶的第20位的天冬酰胺突變為天冬氨酸，同時將第66位的酪氨酸突變為天冬氨酸得到的；命名為N20D/Y66D；該突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；

或所述突變體是將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的NADH氧化酶的第20位的天冬酰胺突變為天冬氨酸，同時將第116位的天冬酰胺突變為谷氨酸得到的；命名為N20D/N116E；該突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述NADH氧化酶的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明還提供了編碼上述NADH氧化酶突變體的基因。

本發明還提供了一種攜帶上述基因的重組載體。

在本發明的一種實施方式中，所述重組載體以pETDust系列載體作為出發載體。